请troubleshoot一个PCR问题。。。见图。。。 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

请troubleshoot一个PCR问题。。。见图。。。

请troubleshoot一个PCR问题。。。见图。。。# Biology - 生物学

a*n2010-08-06 07:08

1 楼

上网搜了一下HSA 2017 contribution limit
HSA contribution limit (employer + employee) Self-only: $3,400 Family: $6
,750
我和我LD 各自都有自己的工作，各自contribute 自己的HSA账号。
我现在已经contribute 了 3400$ 到我自己的HSA 账号。我的问题是，我LD的HSA账号
是能最多存3400$, 还是最后能存
6750 - 3400 = 3350$? 我们俩将会 file jointly tax return.
多谢指教了！

n*w2010-08-06 07:08

2 楼

最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢。

s*n2010-08-06 07:08

3 楼

2nd 挺好的啊

j*o2010-08-06 07:08

4 楼

试试60度退火，72度延伸3分钟，35循环

p*p2010-08-06 07:08

5 楼

做克隆的中心思想是一个就够了。PCR片断做克隆的中心思想是别引进突变了。
综合这两点，你应该用第二个条件，加DNA模板稍微多些，run PCR的循环数减少到30或
以下。加全部样品酶切，纯化。一个克隆就够了。

vector

【在 n***w 的大作中提到】

: 最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
: 里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
: 见图。。。
: 两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
: 我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
: 结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
: 我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
: 循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
: 我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
: 结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。

g*y2010-08-06 07:08

6 楼

72oc 延伸，1kb=1min. 你扩增2.4kb 起码也要2分30秒。最后延伸用7min. 94度2min
, 94度40s, 66度50s, 72度
3min,35个循环, 72度7min，

vector

【在 n***w 的大作中提到】

s*n2010-08-06 07:08

7 楼

我估计他是用Phusion之类高效率的酶，15-30s/kb。

2min

【在 g*****y 的大作中提到】

: 72oc 延伸，1kb=1min. 你扩增2.4kb 起码也要2分30秒。最后延伸用7min. 94度2min
: , 94度40s, 66度50s, 72度
: 3min,35个循环, 72度7min，
:
: vector

s*y2010-08-06 07:08

8 楼

No need to optimize.
USe a high fidelity enzyme to do a firdt run, purify the product with the
exact size from gel, use it as template to run another round of PCR.

vector

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2010-08-06 07:08

9 楼

谢谢ls各位。
关于用前一轮产物做模版，我之前跑过几次，发现目的条带不够强。。。
总觉得，因为前一轮pcr没有纯化，里面东西很多。。。

h*02010-08-06 07:08

10 楼

退火温度太高

n*w2010-08-06 07:08

11 楼

我试了下60度退火，一开始94度2.5分钟。。。见图。。。
这个条件还不错吧。。。
虽然还有些尾巴。。。。

【在 j*********o 的大作中提到】

: 试试60度退火，72度延伸3分钟，35循环

s*y2010-08-06 07:08

12 楼

第一轮是必须在胶上纯化的。
然后第二轮就可以把annealing temp尽情地调高了
另外，你的产物是不是GC比例比较高？

【在 n***w 的大作中提到】

: 谢谢ls各位。
: 关于用前一轮产物做模版，我之前跑过几次，发现目的条带不够强。。。
: 总觉得，因为前一轮pcr没有纯化，里面东西很多。。。

s*r2010-08-06 07:08

13 楼

试试hot start, 加touchdown，有时候有奇效。

最近做克隆，2.4kb的片段已经出来了，现在要做的就是加酶切位点，然后插到vector
里去。但是跑了几次胶，结果不算理想，想进一步optimize，不太清楚怎么做。。。
见图。。。
两个引物的Tm分别是63.8和63.3。
我第一次PCR的条件是94度3min, 94度30s, 65度45s, 72度60s,72度5min，35个循环。
结果见图1。隐约可以在2.5kb左右见到带，但是很faint。曝光2s。
我第二次PCR的条件是94度3min，94度30s, 66度30s, 72度30s，72度5min，仍然是35个
循环。结果见图2，比第一个是要好多了。貌似有些拖尾。。。
我第三次PCR的条件是94度4min, 94度30s, 66度40s，72度40，72度5min, 35个循环。
结果见图3。目的带是强了不少，但是有些弥散，还有些杂带。
我觉得还需要进一步去优化条件。
请大家给我出出主意。。。
谢谢。。
ps，第二次和第三次的引物比第一次多加了0.1ul。。。模版的浓度大概30ng/ul，上了
1ul。
谢谢

【在 n***w 的大作中提到】