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奇怪的PCR结果

奇怪的PCR结果# Biology - 生物学

A*a2010-10-28 07:10

1 楼

花费可以算点数，mile也可以算点数，如果经常飞的话是不是挺划算的？比一般只按花
费算点数的更容易积攒？
查了查JHQ，似乎关于这张卡的讨论只有07年的，最近一两年都没有，不知道有没有什
么新的政策，现在申请这张卡还划算么？跟spg比起来呢？
俺是经常飞的菜鸟。。谢谢~~~

l*i2010-10-28 07:10

2 楼

蛮忙的，先说这一句。

C*e2010-10-28 07:10

3 楼

有个4kb的片段比较难amplify
好不容易折腾得可以P出来了
然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
5'端好几次都给我奇怪的结果：
amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
所以能看到back bone）：
5'TTAGGCCGGCC.....
我得到的就是这样：
5'GCCGGCC......
本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了
直接导致一个限制性酶切位点不完全
primer是IDT定的
从IDT订过可能有上千的primer，从来没有遇到过这样的情况
现在我不知道是primer的问题还是有什么别的原因
版上有人遇到过么？
当然我准备定新的primer看看有没有帮助
不过还是百思不得其解这是怎么回事啊

A*n2010-10-28 07:10

4 楼

不接受新的申请了

【在 A****a 的大作中提到】

: 花费可以算点数，mile也可以算点数，如果经常飞的话是不是挺划算的？比一般只按花
: 费算点数的更容易积攒？
: 查了查JHQ，似乎关于这张卡的讨论只有07年的，最近一两年都没有，不知道有没有什
: 么新的政策，现在申请这张卡还划算么？跟spg比起来呢？
: 俺是经常飞的菜鸟。。谢谢~~~

h*22010-10-28 07:10

5 楼

嗯。

【在 l******i 的大作中提到】

: 蛮忙的，先说这一句。

c*r2010-10-28 07:10

6 楼

嗯，可能原因比较多。
1. 不知道你的primer有多长？有没有HPLC purify？如果cloning可能仅仅desalt是不
够的，尤其是比较长的primer。但是5'少掉比较奇怪，一般合成都是3'少掉几个？
2. 不知道你用的什么polymerase？会不会有5’exonuclease activity？
要不你试试随便加4个base pairs再做一下，就算再少4个base pairs也没关系了。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 有个4kb的片段比较难amplify
: 好不容易折腾得可以P出来了
: 然后放到TOPO-II里面去测序（blunt end）
: 5'端好几次都给我奇怪的结果：
: amplification序列如果是这样（从PCR的primer开始，测序是在insert位点上下游比较远的地方，
: 所以能看到back bone）：
: 5'TTAGGCCGGCC.....
: 我得到的就是这样：
: 5'GCCGGCC......
: 本该是PCR forward primer 5'的四个碱基不见了

p*x2010-10-28 07:10

7 楼

还不如直接申2% everything的...
或者航空公司卡,有的可以免费check in一件行李.

【在 A****a 的大作中提到】

a*u2010-10-28 07:10

8 楼

我也喜欢这里
很温暖

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6

【在 l******i 的大作中提到】

: 蛮忙的，先说这一句。

l*i2010-10-28 07:10

9 楼

紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
里面是否可以看到TOPO II的部分序
列。
我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
思？不能切开还是不能完全切开？

【在 C*******e 的大作中提到】

d*s2010-10-28 07:10

10 楼

我就在用这个卡，免75年费的那拨。这个卡其实不算太好，因为你的奖励要换gift
card，比较麻烦。而且他的fly point 要purchase point 来match，就是说光多飞没用
，还是要多花钱。。。

X*72010-10-28 07:10

11 楼

我也喜欢。

l*a2010-10-28 07:10

12 楼

有过这种情况，不过我的引物比较长。

F*g2010-10-28 07:10

13 楼

飞远程很不错，比如回趟国什么的

【在 d*******s 的大作中提到】

: 我就在用这个卡，免75年费的那拨。这个卡其实不算太好，因为你的奖励要换gift
: card，比较麻烦。而且他的fly point 要purchase point 来match，就是说光多飞没用
: ，还是要多花钱。。。

C*e2010-10-28 07:10

14 楼

我给出的不是紧挨着测序引物的部分
测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
不切（已经试
验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系）

【在 l*****i 的大作中提到】

: 紧挨着测序引物的下游会有一段没有测序结果，或者结果不可信。不知道你的测序结果
: 里面是否可以看到TOPO II的部分序
: 列。
: 我在国内的时候碰到过引物上的酶切位点有错误。还有你说的酶切位点不完全是什么意
: 思？不能切开还是不能完全切开？

C*e2010-10-28 07:10

15 楼

你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么？
在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】

l*i2010-10-28 07:10

16 楼

这种情况应该是引物有错误，测序不太可能出错，因为你酶切的结果也支持这点。如果
你实在还不放心，你可以在4kb片段
上设计一个测序引物，反向测序这个区域。
看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点（只要这个酶切位点和TPO
或者你的目的载体兼容即可），这
样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 我给出的不是紧挨着测序引物的部分
: 测序是从insert上下游比较远的地方（>60 bp）开始测的
: 所以才会很清楚的看到insert 5’比设计的PCR产物少了几个碱基
: 我说的酶切位点没有了是指本来设计的酶切位点是GGCCGGCC，现在只有GCCGGCC，所以
: 不切（已经试
: 验过，而且酶是好的，另外也做过实验跟甲基化没有任何关系）

C*e2010-10-28 07:10

17 楼

谢谢建议
我肯定会重新订引物的
我没有怀疑过测序出错
扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行
这个说起来就话长了
引物都有的
但是因为这个4kb片段比较特殊
没有办法从里面测序

TPO

【在 l*****i 的大作中提到】

: 这种情况应该是引物有错误，测序不太可能出错，因为你酶切的结果也支持这点。如果
: 你实在还不放心，你可以在4kb片段
: 上设计一个测序引物，反向测序这个区域。
: 看来你得重新合成引物。看能不能在这4kb中找一个酶切位点（只要这个酶切位点和TPO
: 或者你的目的载体兼容即可），这
: 样你就不用再次扩增4kb那么大的片断。

c*r2010-10-28 07:10

18 楼

你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs？
我觉得可能是primer漏了4个base pairs

【在 C*******e 的大作中提到】

: 谢谢建议
: 我肯定会重新订引物的
: 我没有怀疑过测序出错
: 扩增的4kb片段上设计引物测序比较不可行
: 这个说起来就话长了
: 引物都有的
: 但是因为这个4kb片段比较特殊
: 没有办法从里面测序
:
: TPO

C*e2010-10-28 07:10

19 楼

呃，这个倒真没查
会查一下
不过还是准备重新定primer
再多加几个碱基

【在 c******r 的大作中提到】

: 你有没有verify一下tube的label上有没有漏掉4个base pairs？
: 我觉得可能是primer漏了4个base pairs

l*a2010-10-28 07:10

20 楼

对，是5’端少的，linker没了。作PCR看着是正确的条带，回收后作连接，怎么也连不
上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 你遇到这种情况也是5'端少而不是3'端少么？
: 在 lischka (smiling cat) 的大作中提到: 】

s*s2010-10-28 07:10

21 楼

长的引物错误是有可能的，我们当年也有一个Linker合成错了，
搞了两三个月才figure out是怎么回事

较远的地方，

【在 C*******e 的大作中提到】

C*e2010-10-28 07:10

22 楼

ft，居然还有这种事情
我以为只有3‘会少
不过24nts就合成错也太搞笑了吧
唉

【在 l*****a 的大作中提到】

: 对，是5’端少的，linker没了。作PCR看着是正确的条带，回收后作连接，怎么也连不
: 上。后来TA克隆测序发现linker没了。只好重新order引物。

y*g2010-10-28 07:10

23 楼

引物合成是从3’到5’的，现在明白了吧？

C*e2010-10-28 07:10

24 楼

还真是不知道
这下明白了

【在 y******g 的大作中提到】

: 引物合成是从3’到5’的，现在明白了吧？

b*r2010-10-28 07:10

25 楼

楼主记得回来讲讲，最后是不是IDT合成引物的问题？
你那测序结果后面的序列都对吗

b*n2010-10-28 07:10

26 楼

太长的引物容易出这种问题
有次我的几个引物（50-60nt）的5'都缺一个A
而我当时不知道，只按照25nm的scale合成
后来他们客服解释说合成时每一个nt正确添加的效率是99%
那么60个nt的引物合成下来最终产物中正确的只有55%
因为引物是从3'->5'合成的，所以5'很容易有deletion
他们建议超过60nt的引物合成使用100nm的scale（每步合成效率达到99.5%）

较远的地方，

【在 C*******e 的大作中提到】