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求助: 克隆 60kb DNA fragment
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求助: 克隆 60kb DNA fragment# Biology - 生物学
u*t
1
背景:
1. 中国护照:我持有J1签证,DS1029到2015年底截止,但是护照上的美国签证是去年
11月份申请的,到今年11月份就到期。护照上还有西欧A国往返签,到2015年大概9月份
结束
2. 西欧A国护照: 白本护照。今年刚刚入籍,护照邮寄到了美国。从未使用过。
3. 西欧A国护照去巴西不需要签证,中国护照需要
问题:想去巴西开会顺便学术交流一个月,怎么办?
我的考虑:
1. 如果我拿中国护照购买机票,机场检查的时候会发现我中国护照上无巴西签证,会
拒绝我登机;我如果出示另外一本护照,可能会引起其它不可预知的麻烦。
2. 如果我拿西欧A国护照购买机票,机场检查的时候会发现我没有在美国的有效签证,
而且我第一次使用就是从美国出去,而没有进来的记录(出入境记录可能会给人一种错
觉:我是非法入境滞留的)。而且我中国护照再次入境美国的时候还要用,这样出入境
记录就导致中国护照2次入境,其中却没有出境了。
谢谢版上达人指点!
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L*y
2
我在的行业员工如果过考试有加薪。手下有个小孩,考试过得飞快,已经达到她职位的
上限。如果不promote她,她以后的加薪都只能以lump sum的形式拿,而不是计入薪水
,对她很不公平。
如果promote她,别的小孩可能不高兴。因为这个人工作态度虽然努力,能力上并没有
特别突出的地方,整天就知道说,到底我要怎么做才能升职,你给我个单子我就照着做
啊。而且因为过考试快,她已经比其他人赚的多多了。她的reputation是喜欢跟别人比
,事事都要拔尖,而能力一般。如果promote她,一是不公平,而且我担心会让大家觉
得,会哭的孩子有奶吃,然后全都跑来哭。
另外HR不同意调整薪水上限。这个已经试过了。
请支招。谢
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7
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t*7
3
各位大侠,
我需要从一个bacteria的chromosome里克隆一段60kb的dna,并放到E.Coli里去表达。请
问有什么好的PCR方法能够克隆60kb的dna的。我目前只看到Roche好像有卖克隆5-20kb
的kit. 不知道有没有直接可以一次pcr 60kb的方法。(如果不行,是不是需要多次克
隆片段,然后ligation?)
还有,如果要放到e.coli表达,一般是用BAC做vector么?大家有相关什么文章可以推
荐阅读的嘛?或者BAC有哪里可以买的么?
先谢谢了。
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f*n
4
进出某个国家要用同一个护照,用最方便进出那个国家的护照。所以:
*进出美国用有美国签证的护照(中国护照)
*进出巴西用西欧A国护照
用什么护照买机票无所谓。check-in的时候航空公司主要想知道你怎么进入目的地国家
的,所以一般显示你用来进入目的地国家的护照。航空公司不会管你在美国的身份。但
是因为现在I-94电子化了,为了在美国的出入境记录系统上有离开的记录,你也应该显
示给他们你的中国护照。
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v*0
5
潜规则再说。

【在 L**********y 的大作中提到】
: 我在的行业员工如果过考试有加薪。手下有个小孩,考试过得飞快,已经达到她职位的
: 上限。如果不promote她,她以后的加薪都只能以lump sum的形式拿,而不是计入薪水
: ,对她很不公平。
: 如果promote她,别的小孩可能不高兴。因为这个人工作态度虽然努力,能力上并没有
: 特别突出的地方,整天就知道说,到底我要怎么做才能升职,你给我个单子我就照着做
: 啊。而且因为过考试快,她已经比其他人赚的多多了。她的reputation是喜欢跟别人比
: ,事事都要拔尖,而能力一般。如果promote她,一是不公平,而且我担心会让大家觉
: 得,会哭的孩子有奶吃,然后全都跑来哭。
: 另外HR不同意调整薪水上限。这个已经试过了。
: 请支招。谢

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b*n
6
看看能不能找公司做吧
自己做起来估计有点麻烦,如果你不熟悉BAC的操作的话

20kb

【在 t********7 的大作中提到】
: 各位大侠,
: 我需要从一个bacteria的chromosome里克隆一段60kb的dna,并放到E.Coli里去表达。请
: 问有什么好的PCR方法能够克隆60kb的dna的。我目前只看到Roche好像有卖克隆5-20kb
: 的kit. 不知道有没有直接可以一次pcr 60kb的方法。(如果不行,是不是需要多次克
: 隆片段,然后ligation?)
: 还有,如果要放到e.coli表达,一般是用BAC做vector么?大家有相关什么文章可以推
: 荐阅读的嘛?或者BAC有哪里可以买的么?
: 先谢谢了。

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u*t
7
大赞!
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q*x
8
if han, yes.
else, no.

【在 L**********y 的大作中提到】
: 我在的行业员工如果过考试有加薪。手下有个小孩,考试过得飞快,已经达到她职位的
: 上限。如果不promote她,她以后的加薪都只能以lump sum的形式拿,而不是计入薪水
: ,对她很不公平。
: 如果promote她,别的小孩可能不高兴。因为这个人工作态度虽然努力,能力上并没有
: 特别突出的地方,整天就知道说,到底我要怎么做才能升职,你给我个单子我就照着做
: 啊。而且因为过考试快,她已经比其他人赚的多多了。她的reputation是喜欢跟别人比
: ,事事都要拔尖,而能力一般。如果promote她,一是不公平,而且我担心会让大家觉
: 得,会哭的孩子有奶吃,然后全都跑来哭。
: 另外HR不同意调整薪水上限。这个已经试过了。
: 请支招。谢

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h*e
9
建库 然后用red/ET recombineering 来stitch ?
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C*t
10
当你取得西欧A国国籍时,较早前申请《美国签证》时的个人情况已发生足以影响你和
你的受养人的逗留身份的重大变化。你和你的受养人的现有的逗留许可和《美国签证》
有可能已失效。
若你不通知CIS便出境,无论这个《美国签证》是否已经失效,你都能再次成功抵达美
国口岸。入境审查时,有经验的CBP可能会通过提问了解到你已取得另一个国籍。这种
情况下,CBP会注销这个《美国签证》并重新评估你的移民倾向,决定是否准许你入境
和逗留期限。
你现在应主动向CIS说明情况。CIS在评估你的情况后大概会注销你的《中国护照》里的
《美国签证》和逗留许可章,在你的西欧A国护照里给你新的逗留许可,并为你更新I-
94资料。出境后,你应持西欧A国护照申请新的《美国签证》来美。
你已丧失中国国籍,依照中国法律,你可能需要持有关文件前往北京驻外使领馆办理有
关手续。
你已丧失中国国籍,切勿向华盛顿当局谎称你具有中国国籍。
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h*t
11
这种情况, 给lump sum很公平啊.

【在 L**********y 的大作中提到】
: 我在的行业员工如果过考试有加薪。手下有个小孩,考试过得飞快,已经达到她职位的
: 上限。如果不promote她,她以后的加薪都只能以lump sum的形式拿,而不是计入薪水
: ,对她很不公平。
: 如果promote她,别的小孩可能不高兴。因为这个人工作态度虽然努力,能力上并没有
: 特别突出的地方,整天就知道说,到底我要怎么做才能升职,你给我个单子我就照着做
: 啊。而且因为过考试快,她已经比其他人赚的多多了。她的reputation是喜欢跟别人比
: ,事事都要拔尖,而能力一般。如果promote她,一是不公平,而且我担心会让大家觉
: 得,会哭的孩子有奶吃,然后全都跑来哭。
: 另外HR不同意调整薪水上限。这个已经试过了。
: 请支招。谢

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t*7
12
Thanks a lot! 你知道有什么公司来做这个的嘛?不知道价格多少?

【在 b******n 的大作中提到】
: 看看能不能找公司做吧
: 自己做起来估计有点麻烦,如果你不熟悉BAC的操作的话
:
: 20kb

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l*i
13
叫到办公室,关上门,把二郎腿跷在桌上,跟她说:
I like your skirt。。。
看她懂不懂规矩再说……
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h*r
14
Rebuilding microbial genomes, BioEssays 29:580–590, 2007 Wiley
Periodicals.
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s*e
15
这是人事政策,你操什么心。 该怎么人事部会告诉你的吧。

【在 L**********y 的大作中提到】
: 我在的行业员工如果过考试有加薪。手下有个小孩,考试过得飞快,已经达到她职位的
: 上限。如果不promote她,她以后的加薪都只能以lump sum的形式拿,而不是计入薪水
: ,对她很不公平。
: 如果promote她,别的小孩可能不高兴。因为这个人工作态度虽然努力,能力上并没有
: 特别突出的地方,整天就知道说,到底我要怎么做才能升职,你给我个单子我就照着做
: 啊。而且因为过考试快,她已经比其他人赚的多多了。她的reputation是喜欢跟别人比
: ,事事都要拔尖,而能力一般。如果promote她,一是不公平,而且我担心会让大家觉
: 得,会哭的孩子有奶吃,然后全都跑来哭。
: 另外HR不同意调整薪水上限。这个已经试过了。
: 请支招。谢

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e*o
16
Pred/ET recombineering ,
easy !
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L*y
17
如果是lump sum,她的401K match, 下次加薪的起点都受影响。

【在 h*****t 的大作中提到】
: 这种情况, 给lump sum很公平啊.
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t*7
18
谢谢! 我想克隆的60kb gene islands 在某一bacteria的genome里,请问能推荐什么好的PCR方法可以一次把它整片段都PCR出来,
是不是只有这样有了linear insert之后,才能用pRed/ET recombineering把60kb插入到BAC plasmid里, 最后transform到另一个strain里?
不好意思,问题可能比较弱....不过真的不知道有什么好办法

【在 e***o 的大作中提到】
: Pred/ET recombineering ,
: easy !

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L*y
19
我不想听她抱怨。我也确实觉得对她不公平。
目前我的打算是,找个难点儿的project让她做。我觉得她不deserve promotion的原因
是她不够独立,需要别人把步骤跟她说清楚。如果她能独立做好这个project,就
promote好了。

【在 s*********e 的大作中提到】
: 这是人事政策,你操什么心。 该怎么人事部会告诉你的吧。
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h*e
20
60KB作为insert 在 Red/ET recombineering 也实在太大啦啊
PCR还要测序 不保险 还是建库吧 然后用Red/ET 来 缝合
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h*t
21
其实是你自己心里不平衡, 想提拔她,知道她不够格, 也怕别人有意见,
但是你用着她也很好用, 心里觉得不帮她有点小负罪感.
你应该跟她有个很好的交流, 好好说说她的career path. 然后让她知道
在什么方向学习, 不要故意搞个难的项目让她做不了才说. 说了才给她
难的项目.

【在 L**********y 的大作中提到】
: 我不想听她抱怨。我也确实觉得对她不公平。
: 目前我的打算是,找个难点儿的project让她做。我觉得她不deserve promotion的原因
: 是她不够独立,需要别人把步骤跟她说清楚。如果她能独立做好这个project,就
: promote好了。

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t*7
22
不知道各位能不能建议一些建库和Red/ET相关的文章,这样我可以知道具体怎么操作和
可行性?
另外gateway需要需要有特定的att次序对来recombination,不知道Red/ET的也是一样
?还是可以任意的次序,只要是相同就可以?
非常谢谢!
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L*y
23
谈过,没用。她听不进去。举个例子。我说,你想从analyst 2 变成3,要能够自主地
改进现有的工作,而不是等着别人来跟你说。
她就会找点无关紧要的东西改一改作为证据。most of the "improvements" are
cosmetic. 那些没有效率的、重复的步骤还是一样的在那里。然后当你心平气和地指出
这些的时候,她就开始发飙,哭,觉得自己好委屈。
让她做已经well defined工作确实合用,因为她刻苦。但是比起她给我的麻烦来,我宁
可没她这个人而我自己加班多做。现在就祈祷哪个recruiter赶紧的把她挖走。

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.7

【在 h*****t 的大作中提到】
: 其实是你自己心里不平衡, 想提拔她,知道她不够格, 也怕别人有意见,
: 但是你用着她也很好用, 心里觉得不帮她有点小负罪感.
: 你应该跟她有个很好的交流, 好好说说她的career path. 然后让她知道
: 在什么方向学习, 不要故意搞个难的项目让她做不了才说. 说了才给她
: 难的项目.

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h*e
24
Volume 12, Issue 3, March 2005, Pages 349-356 Chemistry&Biology
Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in
Pseudomonads via Red/ET Recombineering
Silke C. Wenzel1, 2, Frank Gross1, 2, Youming Zhang3, Jun Fu3, A. Francis
Stewart4 and Rolf Müller1, 2,
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VRP-4FSV963-G&_user=1592387&_coverDate=03%2F31%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1525352222&_rerunOrigin=google&_acct=C000053620&_version
你不会也是做gene cluster的把 要不克隆这么大的基因?
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t*7
25
太感谢你了。 不瞒您说,我确实正要做gene cluster reengineering ...
你肯定做了有很多经验了吧?

in

【在 h***e 的大作中提到】
: Volume 12, Issue 3, March 2005, Pages 349-356 Chemistry&Biology
: Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in
: Pseudomonads via Red/ET Recombineering
: Silke C. Wenzel1, 2, Frank Gross1, 2, Youming Zhang3, Jun Fu3, A. Francis
: Stewart4 and Rolf Müller1, 2,
: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VRP-4FSV963-G&_user=1592387&_coverDate=03%2F31%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1525352222&_rerunOrigin=google&_acct=C000053620&_version
: 你不会也是做gene cluster的把 要不克隆这么大的基因?

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