d*i
2 楼
自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
谢谢!
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
谢谢!
d*i
4 楼
backbone是我们实验室以前做的一个载体,具体最早是怎么来的我没有去追究.
太奇怪了!我对比了测序结果,也不是selfligation,不知道什么连进去了,而且PCR产物
600bp,测序1000多后半段也找不到了.
太奇怪了!我对比了测序结果,也不是selfligation,不知道什么连进去了,而且PCR产物
600bp,测序1000多后半段也找不到了.
p*p
8 楼
TA cloning 需要vector上两头都是3' T-overhang. 单个XcmI不行的。
edit:如果要自己做T-vector, 恐怕还是得老老实实blunt end + T。或者两个XcmI,各产生一个3' T。
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
: 去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
: 谢谢!
edit:如果要自己做T-vector, 恐怕还是得老老实实blunt end + T。或者两个XcmI,各产生一个3' T。
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
: 去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
: 谢谢!
s*r
10 楼
把你测得序列blast一下,看看到底是什么污染。
自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
谢谢!
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
: 去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
: 谢谢!
自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
谢谢!
【在 d****i 的大作中提到】
: 自己做了一个T vector,是把含有XcmI的 linker连进载体,然后酶切得到的。连接后
: 拿到质粒去测序和设计的一样。但是当PCR产物连接进去以后再测序回来发现,连接进
: 去的不知道是啥东西,和PCR产物一点都不一样,也找不到载体的下半部分了(我是用载
: 体上游引物测序的)。56个clone都是这样。
: 大家能不能给我一点提示什么的,我对此怎么都理解不了,不知道哪里出错了。
: 谢谢!
s*n
11 楼
题外话:貌似GC cloning的效率比TA cloning的高不少。
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