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Co-IP 求助# Biology - 生物学

i*z2011-05-23 07:05

1 楼

宝宝3岁了。平时在家很活泼，能说会道，而且很执着（就是那种不达到自己目的就一
直跟你磨的那种），还经常耍无赖
（不太讲道理）。但是一出去就特别胆小，什么都要妈妈。比如说，家里来客人，一个
两个还好，过半小时一小时，只要对
方知道怎么讨小朋友开心，就能熟落。但是要是客人一多，就一直粘着我，不管别人问
她啥，她就叫妈妈。出去就更糟糕
了。看到别的小朋友的玩具，想一起玩，自己是一定不会主动上去的，一定要妈妈去。
妈妈不去，就一直缠着。
最近一直吵着要去学芭蕾，今天下午带她去了。去的时候那个开心啊。可是一到教室门
口，就不肯进去了。说下次再去。我
说妈妈陪你呀，她也不肯。我陪她在里面看了一会，说我们一起过去吧，没想到，拉着
她的手过去，老师就问了一声，小朋
友你叫什么名字，她就开始大哭了。我那个窘啊。这已经是第三次了，每次都是她要去
，我们是从来不强迫她的。
可能是因为她一直是我自己带大了。她从小就特别粘我，其他人谁都不要，到2岁以上
才好点。我们算是经常带她出去的，
平时周末总带她到处走（出去吃饭呀，参加各种活动啊），每年还带她出去旅游好几次。
大家给点建议吧，怎么能push一下她，让她open点？

E*12011-05-23 07:05

2 楼

做蛋白蛋白interaction.蛋白A MW 255KD, 蛋白B MW 58KD，蛋白C MW 229KD.每个蛋白
有GFP, Flag等tag.Overexpression 做Co-IP.
先做A和B的相互作用，用protien A beads，IP后boil.先IP B, WB A.对照有（1）non-
transfected, （2）only transfected with A, 试验组（3）transfected with A and
B. IP后发现（1）没有A,（2）中有weak band of A,（3）中有strong band of A.
然后怀疑A蛋白太大，可能和beads或者antibody for IP有non-specific结合，所以（2
）中有weak band of A.之后change strategy: IP A, WB B.后来发现有同样情况。
请问下大家有没有发现蛋白和protein A beads non-specific结合的情况？
然后又换flag-crosslinked beads 做，IP B, WB A. 用Flag-peptide elute中只有B,
没有A,怀疑蛋白浓度太低。然后boil beads. 发现可以得到positive results: IP 后(
1)(2)中都没A,（3）中有A.推断A与这种beads没有non-specific binding.
然后又开始做A和C的interaction.用flag-crosslinked beads,boil.IP C, WB A.发现
了之前的non-specific binding 现象:（1）没有A,（2）中有weak band of A,（3）中
有strong band of A.这次蛋白浓度很高，因为换了中细胞系表达。现在推断可能用于
蛋白浓度太高，导致A和beads有non-specific binding.下一步准备用flag-peptide
elute,看会不会去除non-specific band.
大家有什么经验，或者意见，建议，请不吝赐教！
在此先谢谢啦！

p*i2011-05-23 07:05

3 楼

多做榜样，你先说，他慢慢学。

【在 i****z 的大作中提到】

: 宝宝3岁了。平时在家很活泼，能说会道，而且很执着（就是那种不达到自己目的就一
: 直跟你磨的那种），还经常耍无赖
: （不太讲道理）。但是一出去就特别胆小，什么都要妈妈。比如说，家里来客人，一个
: 两个还好，过半小时一小时，只要对
: 方知道怎么讨小朋友开心，就能熟落。但是要是客人一多，就一直粘着我，不管别人问
: 她啥，她就叫妈妈。出去就更糟糕
: 了。看到别的小朋友的玩具，想一起玩，自己是一定不会主动上去的，一定要妈妈去。
: 妈妈不去，就一直缠着。
: 最近一直吵着要去学芭蕾，今天下午带她去了。去的时候那个开心啊。可是一到教室门
: 口，就不肯进去了。说下次再去。我

m*52011-05-23 07:05

4 楼

照你的说法，其实你的实验已经没问题了，因为ip B能拉下strong A band
Negative control中有背景太正常了

m*a2011-05-23 07:05

5 楼

我女儿以前也是这样。但经过近两年的daycare锻炼，现在已经非常大方了。我觉得还
是多带出去，多多锻炼，慢慢就开朗大方起来。

g*52011-05-23 07:05

6 楼

yes, control sometime have ghost bands. and post a pic here?

i*z2011-05-23 07:05

7 楼

看来还是努力不够。只是我耐心不够，有时候实在是受不了。要坚持！！！

W*72011-05-23 07:05

8 楼

1）是不必要的，2）应该换成B的tag载体跟A共转（别的组也一样，要有空载体的）
实验你可以先用beads pre-incubate一下，最主要的是降低你的input，我个人的经验
是如果你用1mg以上的input，什么都是阳性的。自己摸索几次看看多少合适你的实验，
因为转染效率不一样，我也不好说多少是最好的，但是一般都控制到500ug一下吧。

w*t2011-05-23 07:05

9 楼

我也是一个人在家带孩子，怕出现楼主这样的情况，现在我每天至少带孩子出门一趟，
主要是去人多的地方，然后就是，我见到带孩子的都主动搭话，也教孩子打招呼，家里
来客人的时候，要求客人们都抱抱孩子，所以孩子至今还不认生。还有就是，在家的妈
妈其实可以找本地的moms meet up，多跟人接触，我这里的meetup就有一点不好，全是
金发白人娃

W*n2011-05-23 07:05

10 楼

同意。我家儿子也害羞，上课不主动发言。有次家长被邀请听课，每次老师向家长提问
，我都举手回答。就是让儿子知道妈妈不仅要求他，自己也是这样做的。

【在 p******i 的大作中提到】

:
: 多做榜样，你先说，他慢慢学。

o*y2011-05-23 07:05

11 楼

课之前可以先说说上课的事情，如上课应该干什么，老师、她应该在一起学习，妈妈在
旁边陪着，妈妈希望她如何等等。课后也多鼓励，多表扬。
还有就是得多出去，多参加活动，多鼓励她。

i*z2011-05-23 07:05

12 楼

她的问题是，去之前，都跟她说得好好的（比如上什么课，妈妈可以不可以陪等等），
自己也表示很有兴趣，但是去了，就
死活不肯进去。之后就是很长时间什么课程都不愿意去。我们的原则是，一般不强迫她
去上课的，尽量多带她出去走走。不
过至今为止没觉得有什么改善。哎，头疼。

【在 o******y 的大作中提到】

: 课之前可以先说说上课的事情，如上课应该干什么，老师、她应该在一起学习，妈妈在
: 旁边陪着，妈妈希望她如何等等。课后也多鼓励，多表扬。
: 还有就是得多出去，多参加活动，多鼓励她。