低表达量蛋白的western请教# Biology - 生物学
j*n
1 楼
刚在IBM网站上看到的
23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
选项：
200
240
246
247
250
小强们有啥想法不？
23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
选项：
200
240
246
247
250
小强们有啥想法不？
M*n
2 楼
如果Seller接受了offer，做完Home Inspection，银行不批怎么办？乞不白花钱？
a*d
3 楼
还有两者有何不同？
A*e
4 楼
请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
的？
我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
的？
我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
s*t
5 楼
看不懂。。。
m*y
6 楼
白花 time for sure.
P*n
7 楼
心无一念或者心无杂念是需要修出来的，简单点说，就像运动员要达到他们那个标准，
都是年复一年练出来的。
问题是怎么练。看看下面有人推荐的焦谛卡禅师的书，你就能知道个大概了。第一步你
要知道你确实杂念纷飞，第二步杂念来了要意识到，第三步，意识到杂念来了，把心念
从杂念收回来。具体怎么做，就是焦谛卡禅师讲的从关注自己的呼吸开始。
【在 a*****d 的大作中提到】
: 还有两者有何不同？
都是年复一年练出来的。
问题是怎么练。看看下面有人推荐的焦谛卡禅师的书，你就能知道个大概了。第一步你
要知道你确实杂念纷飞，第二步杂念来了要意识到，第三步，意识到杂念来了，把心念
从杂念收回来。具体怎么做，就是焦谛卡禅师讲的从关注自己的呼吸开始。
【在 a*****d 的大作中提到】
: 还有两者有何不同？
c*r
8 楼
最好是也有其他的tag，我之前做的GFP fusion蛋白也不是很好detect。也许是
antibody的问题吧
antibody的问题吧
j*n
9 楼
就是找规律哦
【在 s******t 的大作中提到】
: 看不懂。。。
【在 s******t 的大作中提到】
: 看不懂。。。
M*n
10 楼
时间就算了，银子搭进去就不爽了
g*5
11 楼
santa cruz， 赞一个。
l*o
12 楼
我猜246？感觉像是求round()
刚在IBM网站上看到的
23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
选项：
200
240
246
247
250
小强们有啥想法不？
【在 j***n 的大作中提到】
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
: 小强们有啥想法不？
刚在IBM网站上看到的
23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
选项：
200
240
246
247
250
小强们有啥想法不？
【在 j***n 的大作中提到】
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
: 小强们有啥想法不？
q*p
13 楼
只有等银行批了才叫接受offer，然后再做home inspection
这个等银行批offer的时间可以是2周～6个月，所以时间上是很吃亏的，建议还是不碰
的好，除非非它不买。
【在 M**********n 的大作中提到】
: 如果Seller接受了offer，做完Home Inspection，银行不批怎么办？乞不白花钱？
这个等银行批offer的时间可以是2周～6个月，所以时间上是很吃亏的，建议还是不碰
的好，除非非它不买。
【在 M**********n 的大作中提到】
: 如果Seller接受了offer，做完Home Inspection，银行不批怎么办？乞不白花钱？
a*a
14 楼
oe的wb都做不出来。。 这表达量也太那啥了吧。
1. 换EGFP抗体。
2. EGFP后面尽量跟一个tag。
1. 换EGFP抗体。
2. EGFP后面尽量跟一个tag。
s*t
15 楼
然后 246， 250？
关键是 20怎么就一下跳到137.8了呀。
【在 l******o 的大作中提到】
: 我猜246？感觉像是求round()
:
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
关键是 20怎么就一下跳到137.8了呀。
【在 l******o 的大作中提到】
: 我猜246？感觉像是求round()
:
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
g*i
16 楼
其实没关系的，你只管把offer递进去，然后接着看其他的房子，看到有喜欢的接着递
，一般short sale bank approval 以后才做inspection,银行没批你急着查什么啊？
一般Bank approval 后你都有一周的时间做inspection 决定要不要这个房子，在这个
期间撤offer没有penalty。
，一般short sale bank approval 以后才做inspection,银行没批你急着查什么啊？
一般Bank approval 后你都有一周的时间做inspection 决定要不要这个房子，在这个
期间撤offer没有penalty。
A*e
17 楼
vector control 表达量奇高，所以vector没有问题，promoter没有问题，融合蛋白表
达量低，我觉得可能因为表达量高了有毒性，因为这些低表达的，表型就很强烈了。
达量低，我觉得可能因为表达量高了有毒性，因为这些低表达的，表型就很强烈了。
m*n
18 楼
247？
【在 j***n 的大作中提到】
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
: 小强们有啥想法不？
【在 j***n 的大作中提到】
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
: 小强们有啥想法不？
z*o
19 楼
Did you try re-blot the membrane?
sometimes, it will increase the signal.
sometimes, it will increase the signal.
u*s
20 楼
嗯，貌似应该是 246 然后 250
先round到个位，再round到10位
【在 l******o 的大作中提到】
: 我猜246？感觉像是求round()
:
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
先round到个位，再round到10位
【在 l******o 的大作中提到】
: 我猜246？感觉像是求round()
:
: 刚在IBM网站上看到的
: 23.5, 24, 20, 137.8, 138, 140, 246.2
: 选项：
: 200
: 240
: 246
: 247
: 250
J*r
21 楼
IP-western
c*t
22 楼
这题给小学生作有难度!
b*r
23 楼
也许你那个蛋白被修饰或者降解了，这个比较麻烦，不过你起码应该能看到一些size不对的玩意
还有可能是这个蛋白somehow形成了一团包涵体，不溶于一般western buffer，我以前做一个膜蛋白
就碰到过这个问题，每次只能在跑胶空下方一点看到一团黑的。我玩命加百分之几的sds，之后带一直很
漂亮。还有可能有些蛋白不能放95度煮，试试70度煮甚至不煮，搞不好都有用
还有可能是这个蛋白somehow形成了一团包涵体，不溶于一般western buffer，我以前做一个膜蛋白
就碰到过这个问题，每次只能在跑胶空下方一点看到一团黑的。我玩命加百分之几的sds，之后带一直很
漂亮。还有可能有些蛋白不能放95度煮，试试70度煮甚至不煮，搞不好都有用
y*i
24 楼
那为什么是round而不是ceil
【在 u****s 的大作中提到】
: 嗯，貌似应该是 246 然后 250
: 先round到个位，再round到10位
【在 u****s 的大作中提到】
: 嗯，貌似应该是 246 然后 250
: 先round到个位，再round到10位
t*p
25 楼
用 covance的抗体
【在 A*******e 的大作中提到】
: 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
: 所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
: 的？
: 我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
: 不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
【在 A*******e 的大作中提到】
: 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
: 所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
: 的？
: 我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
: 不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
k*a
26 楼
247
三个一组的看，第二个数是第一个书整数部分加一。
三个一组的看，第二个数是第一个书整数部分加一。
y*8
27 楼
If there is a small cleavage required for the protein maturation, very
likely your tag is cleaved and degraded. Change the N-terminal fusion to C-
term or vice versa.
Or use the specific antibody instead of GFP or other tag Abs.
不对的玩意
前做一个膜蛋白
sds，之后带一直很
【在 b****r 的大作中提到】
: 也许你那个蛋白被修饰或者降解了，这个比较麻烦，不过你起码应该能看到一些size不对的玩意
: 还有可能是这个蛋白somehow形成了一团包涵体，不溶于一般western buffer，我以前做一个膜蛋白
: 就碰到过这个问题，每次只能在跑胶空下方一点看到一团黑的。我玩命加百分之几的sds，之后带一直很
: 漂亮。还有可能有些蛋白不能放95度煮，试试70度煮甚至不煮，搞不好都有用
likely your tag is cleaved and degraded. Change the N-terminal fusion to C-
term or vice versa.
Or use the specific antibody instead of GFP or other tag Abs.
不对的玩意
前做一个膜蛋白
sds，之后带一直很
【在 b****r 的大作中提到】
: 也许你那个蛋白被修饰或者降解了，这个比较麻烦，不过你起码应该能看到一些size不对的玩意
: 还有可能是这个蛋白somehow形成了一团包涵体，不溶于一般western buffer，我以前做一个膜蛋白
: 就碰到过这个问题，每次只能在跑胶空下方一点看到一团黑的。我玩命加百分之几的sds，之后带一直很
: 漂亮。还有可能有些蛋白不能放95度煮，试试70度煮甚至不煮，搞不好都有用
s*y
28 楼
anti-GFP from Roche is very specific
For you protein, you may want to consider adding a Kozak sequence in front
of your fusion, if you are using the pEGFP-N vector.
The truth is in front of the free GFP in most cloning vector there is a
Kozak sequence and that's why the free GFP always has great expression, but
if you are using the pEGFP-N vector, because the MCS is in front of the
Kozak sequence, therefore your insert will have no Kozak sequence.
【在 A*******e 的大作中提到】
: 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
: 所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
: 的？
: 我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
: 不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
For you protein, you may want to consider adding a Kozak sequence in front
of your fusion, if you are using the pEGFP-N vector.
The truth is in front of the free GFP in most cloning vector there is a
Kozak sequence and that's why the free GFP always has great expression, but
if you are using the pEGFP-N vector, because the MCS is in front of the
Kozak sequence, therefore your insert will have no Kozak sequence.
【在 A*******e 的大作中提到】
: 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
: 所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
: 的？
: 我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
: 不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了
c*i
29 楼
if you have specific antibody again your protein of interest, there is no
point using GFP-fusion. Try IRES, or 2A sequence, even without tag.
point using GFP-fusion. Try IRES, or 2A sequence, even without tag.
A*e
30 楼
多谢各位的指点。我这个protein是个TF，差不多是个全新的蛋白，所以没有specific
antibody. 我加GFP是因为我想看它的subcellular localization. 如我前面说的，我
的vector没有问题，因为free gfp很亮，无论是看荧光还是western。 我的融合蛋白是
我把我的protein放N段，中间一点link， 还有一段his， 然后就是GFP。 在荧光下我
能看得到特异定位于核的GFP信号，所以我觉得我的construct没有问题。 但是western
出来的带就是非常弱，尤其是我把free gfp vector放一边做control的时候。 我觉得
问题是蛋白表达量很低，我已经把上样量放到极限了。 上面各位给的很好的建议，我
想都试试看
antibody. 我加GFP是因为我想看它的subcellular localization. 如我前面说的，我
的vector没有问题，因为free gfp很亮，无论是看荧光还是western。 我的融合蛋白是
我把我的protein放N段，中间一点link， 还有一段his， 然后就是GFP。 在荧光下我
能看得到特异定位于核的GFP信号，所以我觉得我的construct没有问题。 但是western
出来的带就是非常弱，尤其是我把free gfp vector放一边做control的时候。 我觉得
问题是蛋白表达量很低，我已经把上样量放到极限了。 上面各位给的很好的建议，我
想都试试看
t*p
31 楼
那用his抗体不就结了吗？
specific
western
【在 A*******e 的大作中提到】
: 多谢各位的指点。我这个protein是个TF，差不多是个全新的蛋白，所以没有specific
: antibody. 我加GFP是因为我想看它的subcellular localization. 如我前面说的，我
: 的vector没有问题，因为free gfp很亮，无论是看荧光还是western。 我的融合蛋白是
: 我把我的protein放N段，中间一点link， 还有一段his， 然后就是GFP。 在荧光下我
: 能看得到特异定位于核的GFP信号，所以我觉得我的construct没有问题。 但是western
: 出来的带就是非常弱，尤其是我把free gfp vector放一边做control的时候。 我觉得
: 问题是蛋白表达量很低，我已经把上样量放到极限了。 上面各位给的很好的建议，我
: 想都试试看
specific
western
【在 A*******e 的大作中提到】
: 多谢各位的指点。我这个protein是个TF，差不多是个全新的蛋白，所以没有specific
: antibody. 我加GFP是因为我想看它的subcellular localization. 如我前面说的，我
: 的vector没有问题，因为free gfp很亮，无论是看荧光还是western。 我的融合蛋白是
: 我把我的protein放N段，中间一点link， 还有一段his， 然后就是GFP。 在荧光下我
: 能看得到特异定位于核的GFP信号，所以我觉得我的construct没有问题。 但是western
: 出来的带就是非常弱，尤其是我把free gfp vector放一边做control的时候。 我觉得
: 问题是蛋白表达量很低，我已经把上样量放到极限了。 上面各位给的很好的建议，我
: 想都试试看
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