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做过Mass Spectrometer (MS)的高人请赐教

做过Mass Spectrometer (MS)的高人请赐教# Biology - 生物学

g*x2011-08-24 07:08

1 楼

一直不太相信，但是现在看来杨幂和刘恺威是真的离婚了，
原因不明，不知道是不是大家说的就是李易峰这个小三的问题，
这次俩人现身也没有很亲热，
看样子是真的离婚了，
上次采访杨幂的时候，她没有说没离婚这样的话，只是说现在状态很好。
既然已经不再秀恩爱了，也就是不打算辟谣了，
抛出去炒作的因素，
应该是真的离婚了吧，原因就是李易峰？
李易峰不就是跟杨幂拍了个电影么，都是专业演员，肯定不会因为电影里的亲密镜头而
吃醋离婚的，
狗仔队也并没有拍到过杨幂和李易峰私底下在一起的照片，
所以说是李易峰的问题，没道理呀。。。
我猜他们是有财产纠纷吧，因为之前媒体采访过杨幂问她给自己父母买房子会不会和刘
恺威商量，她说不会，因为她买得起。
这句话其实挺打脸的，刘恺威或者换成随便一个男的都听了不舒服，
就算杨幂经济独立，不靠刘恺威养着，但是也犯不着这么说话，
听着太硬气了，伤感情。
一般女人为了给老公面子，也不会直接这么说话，
怀疑这个时候，他们的婚姻其实就已经有问题了的，到后来杨幂去证券公司，就更加证
实了这一点。

P*a2011-08-24 07:08

2 楼

认识一个男生，朋友的朋友，对他第一印象超好的～～那次是集体活动，后来互相留
电话和msn，电话和msn交流了一个月左右，（他主动7次我3次的比率吧）。电话都打
得很不畅快，因为我非常非常不爱打电话。msn聊得开心因为我宅女我爱聊～～～
上周末他开车1小时过来，小小的喝了咖啡这样子，我自觉过程还挺愉快的呢，美到不
行。他回家后我还鼓足勇气给他打了个询问平安电话（平时非常做作装矜持，从来不干
这事儿），他听起来还挺开心感动的。
结果结果，我华丽丽的杯具啦，现在一周过去了，无电话无msn～～～ 5555555～～～
今天是一周整，我觉得这个也足够说明问题啦，人家转向啦。我对他的印象还是
一如既往的好，评价还是一如既往的高，只不过自己有点伤心罢了。
我想请姐妹们（弟兄们更欢迎现身说法）帮忙监督我，不要没事儿找个借口跟人搭个讪
什么的。类似“这两周过得怎么样？”（很怕我忍不住一周后会装朋友来这套）。千万千
万啊，我们其实是很typical的asking for going out的进程，我可万万不能揣着
明白装糊涂的来这套，丢不起这人啊～～～
哼唧哼唧，背起书包上自习去了，书还丢在图书馆呢。请大家狠狠的砸呀砸～～

m*M2011-08-24 07:08

3 楼

IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
１。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
是否都能被检测到, 不管含量高低？
２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
不同酶消化的肽段拼接在一起）？
谢谢指点。

w*g2011-08-24 07:08

4 楼

刘年纪大了，还—直混在二三线，比李差远了

【在 g*****x 的大作中提到】

: 一直不太相信，但是现在看来杨幂和刘恺威是真的离婚了，
: 原因不明，不知道是不是大家说的就是李易峰这个小三的问题，
: 这次俩人现身也没有很亲热，
: 看样子是真的离婚了，
: 上次采访杨幂的时候，她没有说没离婚这样的话，只是说现在状态很好。
: 既然已经不再秀恩爱了，也就是不打算辟谣了，
: 抛出去炒作的因素，
: 应该是真的离婚了吧，原因就是李易峰？
: 李易峰不就是跟杨幂拍了个电影么，都是专业演员，肯定不会因为电影里的亲密镜头而
: 吃醋离婚的，

n*u2011-08-24 07:08

5 楼

如果感兴趣的话，你为啥不主动问呢。。。

【在 P*******a 的大作中提到】

: 认识一个男生，朋友的朋友，对他第一印象超好的～～那次是集体活动，后来互相留
: 电话和msn，电话和msn交流了一个月左右，（他主动7次我3次的比率吧）。电话都打
: 得很不畅快，因为我非常非常不爱打电话。msn聊得开心因为我宅女我爱聊～～～
: 上周末他开车1小时过来，小小的喝了咖啡这样子，我自觉过程还挺愉快的呢，美到不
: 行。他回家后我还鼓足勇气给他打了个询问平安电话（平时非常做作装矜持，从来不干
: 这事儿），他听起来还挺开心感动的。
: 结果结果，我华丽丽的杯具啦，现在一周过去了，无电话无msn～～～ 5555555～～～
: 今天是一周整，我觉得这个也足够说明问题啦，人家转向啦。我对他的印象还是
: 一如既往的好，评价还是一如既往的高，只不过自己有点伤心罢了。
: 我想请姐妹们（弟兄们更欢迎现身说法）帮忙监督我，不要没事儿找个借口跟人搭个讪

l*o2011-08-24 07:08

6 楼

你最好是跑胶，然后让做质谱的人切带，in gel digestion。IgG 会严重影响其他蛋白
的鉴定。你想要的蛋白不一定所有序列都能检测到，不同的蛋白很不一样，很多时候
可能只cover 20-40%的序列。

【在 m****M 的大作中提到】

: IP(Immunoprecipiation)elute下来的蛋白，用MS来鉴定新相互作用蛋白。
: １。Elute下来的大部分是IgG，其他蛋白complex只是占１－２％，这１－２％的蛋白
: 是否都能被检测到, 不管含量高低？
: ２。就这１－２％中的一个蛋白来说，是不是这个蛋白的所有的序列都能被测到（几个
: 不同酶消化的肽段拼接在一起）？
: 谢谢指点。

f*e2011-08-24 07:08

7 楼

不会吧，就算离婚也不会是出轨李易峰，杨幂的审美观至于这么差吗？我还是相信她的
审美观的。李易峰哪一点比得上刘恺威？谁说刘二三线了？人家一直是男主角好吧！李
演的片子我从来都看不下去，包括古剑奇谭，像shit一样。
如果真的离了，会不会是刘和一众漂亮年轻小花旦演感情戏造成的呢？哈哈！

c*o2011-08-24 07:08

8 楼

说不定他这个星期正好忙呐

【在 P*******a 的大作中提到】

I*y2011-08-24 07:08

9 楼

IgG will screw up your MS - too much noise

【在 m****M 的大作中提到】

p*n2011-08-24 07:08

10 楼

出轨问题

k*a2011-08-24 07:08

11 楼

呵呵~有意思~总觉得这个琢磨来琢磨去的阶段很有趣~

m*M2011-08-24 07:08

12 楼

谢谢大家的指点。
是不是说蛋白含量很少的蛋白就不容易检测到。如果一个蛋白含量占主（９５％，注
：不是IgG），另外一个蛋白占５％。这个蛋白我只能拿到最多６０％的序列？
最近从HEK２９３细胞里纯化蛋白，发现总有几个蛋白跟我的主要蛋白一起纯化出来。
跑native PAGE gel看不到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量比预测的大。但是跑变性胶
就可以看到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量和预测的一样大。对这些杂蛋白很感兴趣，
想知道是什么蛋白。
MS 是目前鉴定蛋白序列最牛X的方法了吧？
哪位给普及一下MS的优缺点？不胜感激

【在 m****M 的大作中提到】

p*n2011-08-24 07:08

13 楼

出轨问题

f*o2011-08-24 07:08

14 楼

good luck girl

s*s2011-08-24 07:08

15 楼

1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
2. 含量越低，越不容易检测到
3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾

【在 m****M 的大作中提到】

s*b2011-08-24 07:08

16 楼

我老公呢，我老公了？？？？？

K*S2011-08-24 07:08

17 楼

You can have an estimated sequence coverage but that depends on lots of
factors. For protein ID, as long as you have 2-3 high confident peptides
matched, it's good enough for everybody (aka, any publications). In your
case, LC-MS/MS based methods will be better than MALDI based method. As
another ID mentioned, SDS gel with In-gel digestion is a pretty good
starting point.

【在 m****M 的大作中提到】

: 谢谢大家的指点。
: 是不是说蛋白含量很少的蛋白就不容易检测到。如果一个蛋白含量占主（９５％，注
: ：不是IgG），另外一个蛋白占５％。这个蛋白我只能拿到最多６０％的序列？
: 最近从HEK２９３细胞里纯化蛋白，发现总有几个蛋白跟我的主要蛋白一起纯化出来。
: 跑native PAGE gel看不到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量比预测的大。但是跑变性胶
: 就可以看到这些杂蛋白，而且主蛋白分子量和预测的一样大。对这些杂蛋白很感兴趣，
: 想知道是什么蛋白。
: MS 是目前鉴定蛋白序列最牛X的方法了吧？
: 哪位给普及一下MS的优缺点？不胜感激

g*k2011-08-24 07:08

18 楼

主要看刘的情商和钱商。貌似晓明的就不错。

s*s2011-08-24 07:08

19 楼

补充一点割胶。
牛人直接割，我比较土比较懒比较慢，还想留个照片啥的，方法
SDS－PAGE直接夹玻璃纸中间干透了，加在实验记录本里面。想起来的
时候可以拿出来拍张照啊，好好研究啊，用marker比在边上做记号啊，对
比一下对照考虑一下切几条带啊。
想起来要切的时候，用kimwiper70%酒精擦把表面擦干净了，用刀在干胶
上把要的条带切出来，放到epptube加点水，放几分钟就恢复了，用tip把
两面掉下来的玻璃纸碎片挑掉，离心把水去掉，就可以送去ms了

【在 s******s 的大作中提到】

: 1. IgG你可以考虑和你的beads crosslink一下，这样就elute不下来了
: 2. 含量越低，越不容易检测到
: 3. 不可能所有片段都检测到，一般有两三个就可以确认了
: 4. 有些蛋白没有trypsin位点，不能用这个方法检测
: 5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
: 6. 一般要跑PAGE割带，这样还是可能有很多垃圾

c*n2011-08-24 07:08

20 楼

我一直觉得杨幂应该勾搭小明，小明才能压住她

m*M2011-08-24 07:08

21 楼

5. 一般你在liquid里面的东西除去测，基本全是垃圾
What's the minimal quantity of protein for MS? What's your mean "liquid"?
must be in organic solvent? Thank you

【在 s******s 的大作中提到】

m*M2011-08-24 07:08

22 楼

Thank you for your suggestion.
How many amino acids I can get from one peptide? 10, 20 or 30 aa?
Thank you

【在 K******S 的大作中提到】

: You can have an estimated sequence coverage but that depends on lots of
: factors. For protein ID, as long as you have 2-3 high confident peptides
: matched, it's good enough for everybody (aka, any publications). In your
: case, LC-MS/MS based methods will be better than MALDI based method. As
: another ID mentioned, SDS gel with In-gel digestion is a pretty good
: starting point.

m*M2011-08-24 07:08

23 楼

直接TCA沉淀出我的蛋白混合物，可以拿去测序吗？还是必须事先消化一下？一个肽段
最多可以得到几个氨基酸的信息？
Thank you

【在 s******s 的大作中提到】

: 补充一点割胶。
: 牛人直接割，我比较土比较懒比较慢，还想留个照片啥的，方法
: SDS－PAGE直接夹玻璃纸中间干透了，加在实验记录本里面。想起来的
: 时候可以拿出来拍张照啊，好好研究啊，用marker比在边上做记号啊，对
: 比一下对照考虑一下切几条带啊。
: 想起来要切的时候，用kimwiper70%酒精擦把表面擦干净了，用刀在干胶
: 上把要的条带切出来，放到epptube加点水，放几分钟就恢复了，用tip把
: 两面掉下来的玻璃纸碎片挑掉，离心把水去掉，就可以送去ms了

b*y2011-08-24 07:08

24 楼

上面有人已经说的很清楚了，就是ip后走sds-page，然后割带去做lc-msms，只要胶上
能看到条带质谱就能出结果。出了结果的情况下要用其它方法来验证是不是真的相互作
用。你上面提到的质谱的具体问题，一个方法就是去看基本的质谱的书或者找帮你做质
谱的人给你解释，都比在这问有效率。

K*S2011-08-24 07:08

25 楼

It depends on your protein's amino acid sequence and what kind of enzyme you
use. For example, trypsin cleaves c-terminus of K and R (not if the
following amino acid is P) so you could get peptides with various length.
Each mass spectrometer has its own mass range that will determine how big/
small it can detect. And if you use LC-MS/MS instrument, the analytical
column also contributes to the detection. C18 columns can't retain
hydrophilic peptides very well.

【在 m****M 的大作中提到】

: Thank you for your suggestion.
: How many amino acids I can get from one peptide? 10, 20 or 30 aa?
: Thank you

s*s2011-08-24 07:08

26 楼

我都说了。这种东西太脏，拿去测出几十上百个蛋白你也不知道哪个是真的。
必须有好的control，然后并排SDS-PAGE，切胶去测

【在 m****M 的大作中提到】

: 直接TCA沉淀出我的蛋白混合物，可以拿去测序吗？还是必须事先消化一下？一个肽段
: 最多可以得到几个氨基酸的信息？
: Thank you

m*M2011-08-24 07:08

27 楼

非常感谢各位的热心帮助。原来只是知道MS，但是一点都不懂，也没有什么core
facility可以咨询。在大家的帮助下，基本上有点眉目了。下一步准备找公司给做后面
的。再次感谢大家的大力帮助。

X*n2011-08-24 07:08

28 楼

最近Ｈａｒｐｅｒ发的几篇文章不都是in solution做出来的，难道都是垃圾？如果他
的那些文章要切胶的话，那不是要切死人？
用ｓｉｌａｃ会不会好一些？
怎样才能提高throughput的同时又不失准确率？

【在 s******s 的大作中提到】

: 我都说了。这种东西太脏，拿去测出几十上百个蛋白你也不知道哪个是真的。
: 必须有好的control，然后并排SDS-PAGE，切胶去测

s*s2011-08-24 07:08

29 楼

没看过什么harper的文章。我这个是对新手说的，人家大牛，实验条件
摸得无比纯属，当然背景会少掉

【在 X******n 的大作中提到】

: 最近Ｈａｒｐｅｒ发的几篇文章不都是in solution做出来的，难道都是垃圾？如果他
: 的那些文章要切胶的话，那不是要切死人？
: 用ｓｉｌａｃ会不会好一些？
: 怎样才能提高throughput的同时又不失准确率？