令人头疼的长引物PCR# Biology - 生物学
H*L
1 楼
Energy, Power, Control and Networks (EPCN)一直pending啊！
好想问问PO，但怕问来个negative!
好想问问PO，但怕问来个negative!
b*1
2 楼
话说平西王吴三桂少年英挺............
g*3
3 楼
白羊座 Aries3月21日～4月19日
金牛座 Taurus 4月20日～5月20日
双子座 Gemini 5月21日～6月21日
巨蟹座 Cancer 6月22日～7月22日
狮子座 Leo 7月23日～8月22日
处女座 Virgo 8月23日～9月22日
天秤座 Libra 9月23日～10月23日
天蝎座 Scorpio 10月24日～11月22日
射手座 Sagittarius 11月23日～12月21日
魔蝎座 Capricorn 12月22日～1月19日
水瓶座 Aquarius 1月20日～2月18日
双鱼座 Pisces 2月19日～3月20日
金牛座 Taurus 4月20日～5月20日
双子座 Gemini 5月21日～6月21日
巨蟹座 Cancer 6月22日～7月22日
狮子座 Leo 7月23日～8月22日
处女座 Virgo 8月23日～9月22日
天秤座 Libra 9月23日～10月23日
天蝎座 Scorpio 10月24日～11月22日
射手座 Sagittarius 11月23日～12月21日
魔蝎座 Capricorn 12月22日～1月19日
水瓶座 Aquarius 1月20日～2月18日
双鱼座 Pisces 2月19日～3月20日
x*y
4 楼
几年不见成熟多啦， 御姐风范气质出众， 哈哈哈
update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
-----------------------------------------------------------------
以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
毕业风华正茂。
update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
-----------------------------------------------------------------
以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
毕业风华正茂。
A*e
5 楼
谁来看？
s*a
6 楼
最近一直在和PCR较劲，至少有2个星期了。
用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
finnzyme HD hotstart polymerase。
特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？
用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
finnzyme HD hotstart polymerase。
特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？
c*s
7 楼
是不是我们也可以吃血卡了？呵呵
i*i
8 楼
rerererere!!!!!
【在 x******y 的大作中提到】
: 几年不见成熟多啦， 御姐风范气质出众， 哈哈哈
: update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
: -----------------------------------------------------------------
: 以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
: 毕业风华正茂。
【在 x******y 的大作中提到】
: 几年不见成熟多啦， 御姐风范气质出众， 哈哈哈
: update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
: -----------------------------------------------------------------
: 以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
: 毕业风华正茂。
A*e
9 楼
等10秒钟，莫人看，就当我奔过了哈
m*5
10 楼
楼主配对区是不是不够specific
i*s
11 楼
休假式的治疗
【在 c*******s 的大作中提到】
: 是不是我们也可以吃血卡了？呵呵
【在 c*******s 的大作中提到】
: 是不是我们也可以吃血卡了？呵呵
K*y
12 楼
请版主合作删贴，本贴和音乐无关
c*e
13 楼
不看
A*e
14 楼
你的是不是20bp的配对区后面接着80bp的尾巴？ 如果这样真的很难p出来，尾巴太长。
我的经历是不要一次加80bp，一次加20-30，p完这轮，再加20-30，这样才能做出来
我的经历是不要一次加80bp，一次加20-30，p完这轮，再加20-30，这样才能做出来
b*1
15 楼
如果平西王叛乱....
【在 c*******s 的大作中提到】
: 是不是我们也可以吃血卡了？呵呵
【在 c*******s 的大作中提到】
: 是不是我们也可以吃血卡了？呵呵
x*y
16 楼
怎样才能和音乐有关呢？ 让俺想想
【在 K*******y 的大作中提到】
: 请版主合作删贴，本贴和音乐无关
【在 K*******y 的大作中提到】
: 请版主合作删贴，本贴和音乐无关
A*e
17 楼
唉，人丑果然莫人看。。。也罢。。。
s*r
18 楼
我搞过一次80个bp的,必须25ul体系，不能配mastermix，然后加betaine
N*g
19 楼
kao, 马上把瓜瓜抓起来回去请功，定是荣华富贵， 还要个破绿卡！
【在 b******1 的大作中提到】
: 如果平西王叛乱....
【在 b******1 的大作中提到】
: 如果平西王叛乱....
i*i
20 楼
灰猫的唱功比以前大增啊！！！
唱得稳了许多，音色也有提高的说。。。
【在 x******y 的大作中提到】
: 怎样才能和音乐有关呢？ 让俺想想
唱得稳了许多，音色也有提高的说。。。
【在 x******y 的大作中提到】
: 怎样才能和音乐有关呢？ 让俺想想
c*e
21 楼
赞自知之明
b*n
22 楼
既然是质粒，用内切酶把你要扩的区段切出来，再用胶分离出来。
N*r
23 楼
就他那幅熊样，也就拿几个土财主立威。
吴三桂可是有赫赫战功的。
吴三桂可是有赫赫战功的。
x*y
24 楼
音色成熟多了，还有一点点娃娃音， 刚刚好
【在 i****i 的大作中提到】
: 灰猫的唱功比以前大增啊！！！
: 唱得稳了许多，音色也有提高的说。。。
【在 i****i 的大作中提到】
: 灰猫的唱功比以前大增啊！！！
: 唱得稳了许多，音色也有提高的说。。。
A*e
25 楼
那就当我奔过了哈
【在 c********e 的大作中提到】
: 不看
【在 c********e 的大作中提到】
: 不看
C*e
26 楼
＋1
模板的问题
【在 b********n 的大作中提到】
: 既然是质粒，用内切酶把你要扩的区段切出来，再用胶分离出来。
模板的问题
【在 b********n 的大作中提到】
: 既然是质粒，用内切酶把你要扩的区段切出来，再用胶分离出来。
K*y
27 楼
不予理睬，再75我，我奔你们2人
c*e
28 楼
I guess so
【在 A******e 的大作中提到】
: 那就当我奔过了哈
【在 A******e 的大作中提到】
: 那就当我奔过了哈
s*a
29 楼
是的，20bp的配对区后面连着80bp的尾巴。之所以这样做主要是因为实验室另外一个
PhD以前就是这样子做的，我的protocol也是按照他以前的修正过来的。
现在他带我做，所以基本上整个克隆策略是“复制”他原来的策略。其实一次加80bp确
实不好，合成时间长，质控不合格重新合成时间更长。
他不大听我的意见，会说他之前都可以，肯定是我的问题。因为做的不顺利，他都说过
我浪费钱了。要是我给他说我想重新合成引物估计他不愿意。
所以现在很郁闷，如果想自己try某个参数什么都想避开他，总是说这个没有影响那个
没有影响。实在郁闷。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 你的是不是20bp的配对区后面接着80bp的尾巴？ 如果这样真的很难p出来，尾巴太长。
: 我的经历是不要一次加80bp，一次加20-30，p完这轮，再加20-30，这样才能做出来
PhD以前就是这样子做的，我的protocol也是按照他以前的修正过来的。
现在他带我做，所以基本上整个克隆策略是“复制”他原来的策略。其实一次加80bp确
实不好，合成时间长，质控不合格重新合成时间更长。
他不大听我的意见，会说他之前都可以，肯定是我的问题。因为做的不顺利，他都说过
我浪费钱了。要是我给他说我想重新合成引物估计他不愿意。
所以现在很郁闷，如果想自己try某个参数什么都想避开他，总是说这个没有影响那个
没有影响。实在郁闷。
【在 A*******e 的大作中提到】
: 你的是不是20bp的配对区后面接着80bp的尾巴？ 如果这样真的很难p出来，尾巴太长。
: 我的经历是不要一次加80bp，一次加20-30，p完这轮，再加20-30，这样才能做出来
i*i
30 楼
嗯嗯！！
【在 x******y 的大作中提到】
: 音色成熟多了，还有一点点娃娃音， 刚刚好
【在 x******y 的大作中提到】
: 音色成熟多了，还有一点点娃娃音， 刚刚好
A*e
31 楼
要不你奔一个，如何？
【在 c********e 的大作中提到】
: 赞自知之明
【在 c********e 的大作中提到】
: 赞自知之明
h*e
32 楼
我也经常做
引物有80甚至100bp的尾巴
高GC可以加DMSO
我们都是用50ul体系 酶有Phusion或者5primer的taq很好pcr的
楼主莫非是要做recombineering？
引物有80甚至100bp的尾巴
高GC可以加DMSO
我们都是用50ul体系 酶有Phusion或者5primer的taq很好pcr的
楼主莫非是要做recombineering？
x*y
33 楼
猫有高屋近照？
【在 K*******y 的大作中提到】
: 不予理睬，再75我，我奔你们2人
【在 K*******y 的大作中提到】
: 不予理睬，再75我，我奔你们2人
A*e
34 楼
：）你是一个好孩子
【在 c********e 的大作中提到】
: I guess so
【在 c********e 的大作中提到】
: I guess so
s*a
35 楼
是要做recombineering
我用的也是Phusion的
Finnzymes’ Phusion® Hot Start ii High-Fidelity DNA Polymerase
有一次P出来过，条件是：
MgCl2 1.5mM
DMSO 3%
Polymerase 1U/100µl
Template 50ng/100µl
Primers 250nM-250nM
dNTPs 200µM
当时是25µl体系
huiee同学经常做，不知道用的什么条件？
我用的也是Phusion的
Finnzymes’ Phusion® Hot Start ii High-Fidelity DNA Polymerase
有一次P出来过，条件是：
MgCl2 1.5mM
DMSO 3%
Polymerase 1U/100µl
Template 50ng/100µl
Primers 250nM-250nM
dNTPs 200µM
当时是25µl体系
huiee同学经常做，不知道用的什么条件？
x*y
36 楼
现在人少， 高屋奔个近照
c*e
37 楼
为什么要我奔
【在 A******e 的大作中提到】
: 要不你奔一个，如何？
【在 A******e 的大作中提到】
: 要不你奔一个，如何？
s*a
38 楼
是说模板导致的unspcific priming吗？
【在 b********n 的大作中提到】
: 既然是质粒，用内切酶把你要扩的区段切出来，再用胶分离出来。
【在 b********n 的大作中提到】
: 既然是质粒，用内切酶把你要扩的区段切出来，再用胶分离出来。
i*i
39 楼
不能便宜了潜水员们。:-p
改天咱们整实时的 google hangout 或者 tinychat 啥的，
每个参加的人都奔视频，hoho。。。
【在 x******y 的大作中提到】
: 现在人少， 高屋奔个近照
改天咱们整实时的 google hangout 或者 tinychat 啥的，
每个参加的人都奔视频，hoho。。。
【在 x******y 的大作中提到】
: 现在人少， 高屋奔个近照
c*e
40 楼
奔了又如何？
【在 A******e 的大作中提到】
: ：）你是一个好孩子
【在 A******e 的大作中提到】
: ：）你是一个好孩子
b*n
41 楼
一则减少长尾巴在其他地方的配对； 二则完整质粒热变性易复原，线性DNA较易分开，
这个对最初几轮PCR很重要。
这个对最初几轮PCR很重要。
x*y
42 楼
对对， 哈哈
google hangout 好用么？
【在 i****i 的大作中提到】
: 不能便宜了潜水员们。:-p
: 改天咱们整实时的 google hangout 或者 tinychat 啥的，
: 每个参加的人都奔视频，hoho。。。
google hangout 好用么？
【在 i****i 的大作中提到】
: 不能便宜了潜水员们。:-p
: 改天咱们整实时的 google hangout 或者 tinychat 啥的，
: 每个参加的人都奔视频，hoho。。。
A*e
43 楼
他们不是说你帅么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 为什么要我奔
【在 c********e 的大作中提到】
: 为什么要我奔
s*a
44 楼
谢谢，有道理。
如果质粒热变性容易复原，能通过增加initial denaturing的时间来改善PCR效率吗？
【在 b********n 的大作中提到】
: 一则减少长尾巴在其他地方的配对； 二则完整质粒热变性易复原，线性DNA较易分开，
: 这个对最初几轮PCR很重要。
如果质粒热变性容易复原，能通过增加initial denaturing的时间来改善PCR效率吗？
【在 b********n 的大作中提到】
: 一则减少长尾巴在其他地方的配对； 二则完整质粒热变性易复原，线性DNA较易分开，
: 这个对最初几轮PCR很重要。
i*i
45 楼
好用的很！！
我从三多那里知道这个东东的，这里有一个实例：
http://www.youtube.com/watch?v=22IyCkCMuqo
【在 x******y 的大作中提到】
: 对对， 哈哈
: google hangout 好用么？
我从三多那里知道这个东东的，这里有一个实例：
http://www.youtube.com/watch?v=22IyCkCMuqo
【在 x******y 的大作中提到】
: 对对， 哈哈
: google hangout 好用么？
c*e
46 楼
帅又怎么了？
【在 A******e 的大作中提到】
: 他们不是说你帅么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 他们不是说你帅么？
b*n
47 楼
那个没有什麽用，两条链还搅在一起，很容易回复。
w*w
48 楼
技术贴
顶~~
顶~~
A*e
49 楼
给你发100伪币？
【在 c********e 的大作中提到】
: 奔了又如何？
【在 c********e 的大作中提到】
: 奔了又如何？
g*y
50 楼
1. use betain instead of DMSO. I tried them side by side and found that
when I used DMSO, there was increased error rate.
2. try phusion:taq 1:1 mixture instead of phusion alone.
【在 s******a 的大作中提到】
: 最近一直在和PCR较劲，至少有2个星期了。
: 用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
: finnzyme HD hotstart polymerase。
: 特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
: 哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？
when I used DMSO, there was increased error rate.
2. try phusion:taq 1:1 mixture instead of phusion alone.
【在 s******a 的大作中提到】
: 最近一直在和PCR较劲，至少有2个星期了。
: 用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
: finnzyme HD hotstart polymerase。
: 特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
: 哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？
i*i
51 楼
LOL。。。
【在 w***w 的大作中提到】
: 技术贴
: 顶~~
【在 w***w 的大作中提到】
: 技术贴
: 顶~~
c*e
52 楼
伪币有毛用？
【在 A******e 的大作中提到】
: 给你发100伪币？
【在 A******e 的大作中提到】
: 给你发100伪币？
g*y
53 楼
I never use plasmid as template actually.
To save time and hassles, I almost always use bacteria directly as template
and it always work.
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢，有道理。
: 如果质粒热变性容易复原，能通过增加initial denaturing的时间来改善PCR效率吗？
To save time and hassles, I almost always use bacteria directly as template
and it always work.
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢，有道理。
: 如果质粒热变性容易复原，能通过增加initial denaturing的时间来改善PCR效率吗？
b*a
54 楼
小楼你。。。
人家本来就气质出众好不好
人家本来就气质出众好不好
A*e
55 楼
看看呗
【在 c********e 的大作中提到】
: 帅又怎么了？
【在 c********e 的大作中提到】
: 帅又怎么了？
g*y
56 楼
40-50bp homologous region is enough for recombineering.
Next time, you can order 20bp primers first and do a test run, if it is very
robust and specific, then you can order 70bp primers which contains extra
recombination region.
【在 s******a 的大作中提到】
: 是的，20bp的配对区后面连着80bp的尾巴。之所以这样做主要是因为实验室另外一个
: PhD以前就是这样子做的，我的protocol也是按照他以前的修正过来的。
: 现在他带我做，所以基本上整个克隆策略是“复制”他原来的策略。其实一次加80bp确
: 实不好，合成时间长，质控不合格重新合成时间更长。
: 他不大听我的意见，会说他之前都可以，肯定是我的问题。因为做的不顺利，他都说过
: 我浪费钱了。要是我给他说我想重新合成引物估计他不愿意。
: 所以现在很郁闷，如果想自己try某个参数什么都想避开他，总是说这个没有影响那个
: 没有影响。实在郁闷。
Next time, you can order 20bp primers first and do a test run, if it is very
robust and specific, then you can order 70bp primers which contains extra
recombination region.
【在 s******a 的大作中提到】
: 是的，20bp的配对区后面连着80bp的尾巴。之所以这样做主要是因为实验室另外一个
: PhD以前就是这样子做的，我的protocol也是按照他以前的修正过来的。
: 现在他带我做，所以基本上整个克隆策略是“复制”他原来的策略。其实一次加80bp确
: 实不好，合成时间长，质控不合格重新合成时间更长。
: 他不大听我的意见，会说他之前都可以，肯定是我的问题。因为做的不顺利，他都说过
: 我浪费钱了。要是我给他说我想重新合成引物估计他不愿意。
: 所以现在很郁闷，如果想自己try某个参数什么都想避开他，总是说这个没有影响那个
: 没有影响。实在郁闷。
a*g
57 楼
貌似错过了看气质美女的机会，哭。。。。
A*e
58 楼
不晓得。。。你再去买美女的奔？
【在 c********e 的大作中提到】
: 伪币有毛用？
【在 c********e 的大作中提到】
: 伪币有毛用？
s*a
59 楼
谢谢楼上各位的建议
用纯化过的当模板，现在已经能够稳定的P出来我要的东西
very
【在 g***y 的大作中提到】
: 40-50bp homologous region is enough for recombineering.
: Next time, you can order 20bp primers first and do a test run, if it is very
: robust and specific, then you can order 70bp primers which contains extra
: recombination region.
用纯化过的当模板，现在已经能够稳定的P出来我要的东西
very
【在 g***y 的大作中提到】
: 40-50bp homologous region is enough for recombineering.
: Next time, you can order 20bp primers first and do a test run, if it is very
: robust and specific, then you can order 70bp primers which contains extra
: recombination region.
S*e
60 楼
天啦。。今儿错过了NNNN多的奔啊。。。。。
c*e
61 楼
看完之后呢？
【在 A******e 的大作中提到】
: 看看呗
【在 A******e 的大作中提到】
: 看看呗
l*1
62 楼
问句楼上: 用的是QIAGEN 纯化kit? QIAquick PCR Purification Kit or
Small-Scale Plasmid DNA Purification Kits etc...
Small-Scale Plasmid DNA Purification Kits etc...
c*t
63 楼
谁来看看，这个值不值个包子。
狼歌狼舞月风漫生少许朗，
浪涌浪流秋水淘尽几多愁。
【在 x******y 的大作中提到】
: 几年不见成熟多啦， 御姐风范气质出众， 哈哈哈
: update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
: -----------------------------------------------------------------
: 以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
: 毕业风华正茂。
狼歌狼舞月风漫生少许朗，
浪涌浪流秋水淘尽几多愁。
【在 x******y 的大作中提到】
: 几年不见成熟多啦， 御姐风范气质出众， 哈哈哈
: update: （绞尽脑汁把这个八卦帖和音乐联系上， 不然灰猫爪子要挠人了）
: -----------------------------------------------------------------
: 以前一看就是唱校园民谣，高中校园，的青春玉女。 现在看起来是大御姐风范，大学
: 毕业风华正茂。
A*e
64 楼
帅的话，可以调戏调戏
【在 c********e 的大作中提到】
: 看完之后呢？
【在 c********e 的大作中提到】
: 看完之后呢？
h*e
65 楼
dddH2O 34ul
5X buffer 10ul
dNTPs 20mM 1ul
primer1 50mM 1ul
primer2 50mM 1ul
DMSO 1.5ul
template 1ul
Phusion 0.5ul
【在 s******a 的大作中提到】
: 是要做recombineering
: 我用的也是Phusion的
: Finnzymes’ Phusion® Hot Start ii High-Fidelity DNA Polymerase
: 有一次P出来过，条件是：
: MgCl2 1.5mM
: DMSO 3%
: Polymerase 1U/100µl
: Template 50ng/100µl
: Primers 250nM-250nM
: dNTPs 200µM
5X buffer 10ul
dNTPs 20mM 1ul
primer1 50mM 1ul
primer2 50mM 1ul
DMSO 1.5ul
template 1ul
Phusion 0.5ul
【在 s******a 的大作中提到】
: 是要做recombineering
: 我用的也是Phusion的
: Finnzymes’ Phusion® Hot Start ii High-Fidelity DNA Polymerase
: 有一次P出来过，条件是：
: MgCl2 1.5mM
: DMSO 3%
: Polymerase 1U/100µl
: Template 50ng/100µl
: Primers 250nM-250nM
: dNTPs 200µM
w*w
66 楼
上海滩~~
【在 c********t 的大作中提到】
: 谁来看看，这个值不值个包子。
: 狼歌狼舞月风漫生少许朗，
: 浪涌浪流秋水淘尽几多愁。
c*e
67 楼
怎么调戏？
【在 A******e 的大作中提到】
: 帅的话，可以调戏调戏
【在 A******e 的大作中提到】
: 帅的话，可以调戏调戏
s*a
68 楼
Qiagen
QiaQuick Gel Extraction Kit
【在 l**********1 的大作中提到】
: 问句楼上: 用的是QIAGEN 纯化kit? QIAquick PCR Purification Kit or
: Small-Scale Plasmid DNA Purification Kits etc...
QiaQuick Gel Extraction Kit
【在 l**********1 的大作中提到】
: 问句楼上: 用的是QIAGEN 纯化kit? QIAquick PCR Purification Kit or
: Small-Scale Plasmid DNA Purification Kits etc...
c*t
69 楼
嗯，不同的理解，类似的意思，哈哈！
【在 w***w 的大作中提到】
:
: 上海滩~~
【在 w***w 的大作中提到】
:
: 上海滩~~
c*e
70 楼
我是那种武松似的帅，谁调戏我，我就把她一刀给砍了
【在 A******e 的大作中提到】
: 帅的话，可以调戏调戏
【在 A******e 的大作中提到】
: 帅的话，可以调戏调戏
w*w
71 楼
程程，你在哪里~~
【在 c********t 的大作中提到】
: 嗯，不同的理解，类似的意思，哈哈！
A*e
72 楼
看了再说呀。。。调戏都是即兴的。。。不然不好玩呀
【在 c********e 的大作中提到】
: 怎么调戏？
【在 c********e 的大作中提到】
: 怎么调戏？
c*t
73 楼
我的家在东北松花江上
【在 w***w 的大作中提到】
:
: 程程，你在哪里~~
【在 w***w 的大作中提到】
:
: 程程，你在哪里~~
A*e
74 楼
现在算是调戏你么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 我是那种武松似的帅，谁调戏我，我就把她一刀给砍了
【在 c********e 的大作中提到】
: 我是那种武松似的帅，谁调戏我，我就把她一刀给砍了
c*e
75 楼
怎么，你要玩命？
【在 A******e 的大作中提到】
: 看了再说呀。。。调戏都是即兴的。。。不然不好玩呀
【在 A******e 的大作中提到】
: 看了再说呀。。。调戏都是即兴的。。。不然不好玩呀
A*e
76 楼
不要这么认真吧？调戏一下而已啊。莫情趣！
【在 c********e 的大作中提到】
: 怎么，你要玩命？
【在 c********e 的大作中提到】
: 怎么，你要玩命？
c*e
77 楼
算
【在 A******e 的大作中提到】
: 现在算是调戏你么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 现在算是调戏你么？
c*e
78 楼
士可杀，不可辱
【在 A******e 的大作中提到】
: 不要这么认真吧？调戏一下而已啊。莫情趣！
【在 A******e 的大作中提到】
: 不要这么认真吧？调戏一下而已啊。莫情趣！
A*e
79 楼
还要么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 算
【在 c********e 的大作中提到】
: 算
c*e
80 楼
不要了，哎，我其实不想来了，好好聊聊天吧
【在 A******e 的大作中提到】
: 还要么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 还要么？
A*e
81 楼
可怜见滴。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 士可杀，不可辱
【在 c********e 的大作中提到】
: 士可杀，不可辱
A*e
82 楼
好吧。聊什么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 不要了，哎，我其实不想来了，好好聊聊天吧
【在 c********e 的大作中提到】
: 不要了，哎，我其实不想来了，好好聊聊天吧
c*e
83 楼
我想超脱一阵子，想戒网，想避色
【在 A******e 的大作中提到】
: 好吧。聊什么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 好吧。聊什么？
A*e
84 楼
唉。。。又莫的调戏了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 好吧。聊什么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 好吧。聊什么？
c*e
85 楼
你要调戏，买买提随便抓可以抓一大把嘛，欺负我干嘛
【在 A******e 的大作中提到】
: 唉。。。又莫的调戏了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 唉。。。又莫的调戏了。。。
A*e
86 楼
要找好玩的调戏啊。。。难得遇到好玩滴
【在 c********e 的大作中提到】
: 你要调戏，买买提随便抓可以抓一大把嘛，欺负我干嘛
【在 c********e 的大作中提到】
: 你要调戏，买买提随便抓可以抓一大把嘛，欺负我干嘛
c*e
87 楼
每天早上去跑步，去游泳，晚上举重，打球，早睡，想物我两忘
【在 A******e 的大作中提到】
: 唉。。。又莫的调戏了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 唉。。。又莫的调戏了。。。
A*e
88 楼
戒网很容易啊
我也想戒网，白天似乎很有效了。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 我想超脱一阵子，想戒网，想避色
我也想戒网，白天似乎很有效了。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 我想超脱一阵子，想戒网，想避色
c*e
89 楼
现实生活中玩不？
为啥不抓个人现实生活中玩
【在 A******e 的大作中提到】
: 要找好玩的调戏啊。。。难得遇到好玩滴
为啥不抓个人现实生活中玩
【在 A******e 的大作中提到】
: 要找好玩的调戏啊。。。难得遇到好玩滴
A*e
90 楼
我都早上跑步的。。。最近的大周末打乱了作息。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 每天早上去跑步，去游泳，晚上举重，打球，早睡，想物我两忘
【在 c********e 的大作中提到】
: 每天早上去跑步，去游泳，晚上举重，打球，早睡，想物我两忘
c*e
91 楼
我白天都很少上，白天有白天的事
【在 A******e 的大作中提到】
: 戒网很容易啊
: 我也想戒网，白天似乎很有效了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 戒网很容易啊
: 我也想戒网，白天似乎很有效了。。。
A*e
92 楼
现实中，不敢。。。
我怕对方纠缠。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 现实生活中玩不？
: 为啥不抓个人现实生活中玩
我怕对方纠缠。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 现实生活中玩不？
: 为啥不抓个人现实生活中玩
c*e
93 楼
要坚持，不要睡懒觉，暑假食欲差，是打造身体的好时候
【在 A******e 的大作中提到】
: 我都早上跑步的。。。最近的大周末打乱了作息。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 我都早上跑步的。。。最近的大周末打乱了作息。。。
c*e
94 楼
那网上你不怕纠缠？girl版那些大妈都防我防贼似的
【在 A******e 的大作中提到】
: 现实中，不敢。。。
: 我怕对方纠缠。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 现实中，不敢。。。
: 我怕对方纠缠。。。
A*e
95 楼
嗯嗯，周末白天比较能睡。。。一遇到party，晨跑基本就泡汤了。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 要坚持，不要睡懒觉，暑假食欲差，是打造身体的好时候
【在 c********e 的大作中提到】
: 要坚持，不要睡懒觉，暑假食欲差，是打造身体的好时候
c*e
96 楼
party好玩么？跟我分享一下有什么好玩的
【在 A******e 的大作中提到】
: 嗯嗯，周末白天比较能睡。。。一遇到party，晨跑基本就泡汤了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 嗯嗯，周末白天比较能睡。。。一遇到party，晨跑基本就泡汤了。。。
A*e
97 楼
你名声这么坏么？
网上不怕。你又不至于 stalk我，想想我那么丑。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 那网上你不怕纠缠？girl版那些大妈都防我防贼似的
网上不怕。你又不至于 stalk我，想想我那么丑。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 那网上你不怕纠缠？girl版那些大妈都防我防贼似的
A*e
98 楼
没啥好玩的，就是吃吃喝喝，然后女生打扮得漂漂亮亮的showoff
【在 c********e 的大作中提到】
: party好玩么？跟我分享一下有什么好玩的
【在 c********e 的大作中提到】
: party好玩么？跟我分享一下有什么好玩的
c*e
99 楼
男生呢，没什么行动么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 没啥好玩的，就是吃吃喝喝，然后女生打扮得漂漂亮亮的showoff
【在 A******e 的大作中提到】
: 没啥好玩的，就是吃吃喝喝，然后女生打扮得漂漂亮亮的showoff
c*e
100 楼
我觉得我挺好，她们觉得我很坏，我说她们都是高度近视
【在 A******e 的大作中提到】
: 你名声这么坏么？
: 网上不怕。你又不至于 stalk我，想想我那么丑。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 你名声这么坏么？
: 网上不怕。你又不至于 stalk我，想想我那么丑。。。
A*e
101 楼
面上不晓得啊。。。我这么丑。。。哪里知道美女的事？
【在 c********e 的大作中提到】
: 男生呢，没什么行动么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 男生呢，没什么行动么？
A*e
102 楼
目前感觉你还行。
【在 c********e 的大作中提到】
: 我觉得我挺好，她们觉得我很坏，我说她们都是高度近视
【在 c********e 的大作中提到】
: 我觉得我挺好，她们觉得我很坏，我说她们都是高度近视
A*e
103 楼
你是男生，你说说你一般会有什么行动
【在 c********e 的大作中提到】
: 男生呢，没什么行动么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 男生呢，没什么行动么？
c*e
104 楼
不要羡慕美女，美女也有很多麻烦事
我觉得是什么容貌就是什么容貌，无论美丑，it's a gift
我绝对不会去整容
【在 A******e 的大作中提到】
: 面上不晓得啊。。。我这么丑。。。哪里知道美女的事？
我觉得是什么容貌就是什么容貌，无论美丑，it's a gift
我绝对不会去整容
【在 A******e 的大作中提到】
: 面上不晓得啊。。。我这么丑。。。哪里知道美女的事？
c*e
105 楼
行动？这样的party我都懒得去，无聊
【在 A******e 的大作中提到】
: 你是男生，你说说你一般会有什么行动
【在 A******e 的大作中提到】
: 你是男生，你说说你一般会有什么行动
A*e
106 楼
哈哈。。。你不帅？
【在 c********e 的大作中提到】
: 不要羡慕美女，美女也有很多麻烦事
: 我觉得是什么容貌就是什么容貌，无论美丑，it's a gift
: 我绝对不会去整容
【在 c********e 的大作中提到】
: 不要羡慕美女，美女也有很多麻烦事
: 我觉得是什么容貌就是什么容貌，无论美丑，it's a gift
: 我绝对不会去整容
c*e
107 楼
帅，我是站在女人角度上说我不会去整容
【在 A******e 的大作中提到】
: 哈哈。。。你不帅？
【在 A******e 的大作中提到】
: 哈哈。。。你不帅？
A*e
108 楼
传说中的宅男？
【在 c********e 的大作中提到】
: 行动？这样的party我都懒得去，无聊
【在 c********e 的大作中提到】
: 行动？这样的party我都懒得去，无聊
c*e
109 楼
我就喜欢在球场上跟人家斗牛，和女人还能干啥，做饭？懒，打牌,
打个一晚上能赢1刀咋地？逛街？我通常购物就是拿了就走，价格都不看，
生怕耽误一分钟，哪能墨迹一天啊
打个一晚上能赢1刀咋地？逛街？我通常购物就是拿了就走，价格都不看，
生怕耽误一分钟，哪能墨迹一天啊
A*e
110 楼
哦，我也不整容，怕疼。。。更怕不是自己的东西天天时时跟着我。。。想想就很诡异
。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 帅，我是站在女人角度上说我不会去整容
。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 帅，我是站在女人角度上说我不会去整容
c*e
111 楼
喜欢户外活动，滑雪，滑冰，球类活动，漂流等。
A*e
112 楼
你这样，有女生喜欢你么？
【在 c********e 的大作中提到】
: 我就喜欢在球场上跟人家斗牛，和女人还能干啥，做饭？懒，打牌,
: 打个一晚上能赢1刀咋地？逛街？我通常购物就是拿了就走，价格都不看，
: 生怕耽误一分钟，哪能墨迹一天啊
【在 c********e 的大作中提到】
: 我就喜欢在球场上跟人家斗牛，和女人还能干啥，做饭？懒，打牌,
: 打个一晚上能赢1刀咋地？逛街？我通常购物就是拿了就走，价格都不看，
: 生怕耽误一分钟，哪能墨迹一天啊
A*e
113 楼
户外运动不错。但是女生都怕晒黑的说。。。
c*e
114 楼
没有，我一个人独来独往，一个女生都不认识
【在 A******e 的大作中提到】
: 你这样，有女生喜欢你么？
【在 A******e 的大作中提到】
: 你这样，有女生喜欢你么？
c*e
115 楼
我都是跟哥们出去玩的，唯一认识的就是他们的女朋友们
【在 A******e 的大作中提到】
: 户外运动不错。但是女生都怕晒黑的说。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 户外运动不错。但是女生都怕晒黑的说。。。
A*e
116 楼
你太孤僻了。。。不觉得缺憾？
【在 c********e 的大作中提到】
: 没有，我一个人独来独往，一个女生都不认识
【在 c********e 的大作中提到】
: 没有，我一个人独来独往，一个女生都不认识
A*e
117 楼
困了。。。睡觉觉去了。。。
c*e
118 楼
不觉得，就像大学生看幼儿园的小孩摆积木一样，横着竖着，就那么几种摆法。只要是
本帅哥喜欢的美女，这辈子还从来没有被拒绝过。
我也很花心，有的时候手都没摸，三天就腻了，觉得这人怎么这么boring,不好玩。
【在 A******e 的大作中提到】
: 你太孤僻了。。。不觉得缺憾？
本帅哥喜欢的美女，这辈子还从来没有被拒绝过。
我也很花心，有的时候手都没摸，三天就腻了，觉得这人怎么这么boring,不好玩。
【在 A******e 的大作中提到】
: 你太孤僻了。。。不觉得缺憾？
A*e
119 楼
估计你还莫喜欢的美女lol
【在 c********e 的大作中提到】
: 不觉得，就像大学生看幼儿园的小孩摆积木一样，横着竖着，就那么几种摆法。只要是
: 本帅哥喜欢的美女，这辈子还从来没有被拒绝过。
: 我也很花心，有的时候手都没摸，三天就腻了，觉得这人怎么这么boring,不好玩。
【在 c********e 的大作中提到】
: 不觉得，就像大学生看幼儿园的小孩摆积木一样，横着竖着，就那么几种摆法。只要是
: 本帅哥喜欢的美女，这辈子还从来没有被拒绝过。
: 我也很花心，有的时候手都没摸，三天就腻了，觉得这人怎么这么boring,不好玩。
c*e
120 楼
困毛，再聊一会儿，明天我真不来了
【在 A******e 的大作中提到】
: 困了。。。睡觉觉去了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 困了。。。睡觉觉去了。。。
c*e
121 楼
你呢
【在 A******e 的大作中提到】
: 估计你还莫喜欢的美女lol
【在 A******e 的大作中提到】
: 估计你还莫喜欢的美女lol
A*e
122 楼
那你奔一个吧，我好提提精神
【在 c********e 的大作中提到】
: 困毛，再聊一会儿，明天我真不来了
【在 c********e 的大作中提到】
: 困毛，再聊一会儿，明天我真不来了
A*e
123 楼
我？实话还是谎话？
【在 c********e 的大作中提到】
: 你呢
【在 c********e 的大作中提到】
: 你呢
c*e
124 楼
有的时候觉得有些女的不买那个包会死啊，花个几百买个包，我就是捐了也不买那种
马桶式的包。还有的，你别看贼美，有个长得贼丑的男的砸重金买了个包包，那女的
就跟他了，当然了，成了我们的饭后笑料。
【在 A******e 的大作中提到】
: 估计你还莫喜欢的美女lol
马桶式的包。还有的，你别看贼美，有个长得贼丑的男的砸重金买了个包包，那女的
就跟他了，当然了，成了我们的饭后笑料。
【在 A******e 的大作中提到】
: 估计你还莫喜欢的美女lol
c*e
125 楼
实话
【在 A******e 的大作中提到】
: 我？实话还是谎话？
【在 A******e 的大作中提到】
: 我？实话还是谎话？
c*e
126 楼
你要睡觉我们就到此为止，不睡觉就继续
【在 A******e 的大作中提到】
: 那你奔一个吧，我好提提精神
【在 A******e 的大作中提到】
: 那你奔一个吧，我好提提精神
A*e
127 楼
喜欢我的人太多咯。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 实话
【在 c********e 的大作中提到】
: 实话
c*e
128 楼
赞！对了，上次你还没回答我呢，你这个ID从哪冒出来的，怎么以前没见过你啊
【在 A******e 的大作中提到】
: 喜欢我的人太多咯。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 喜欢我的人太多咯。。。
A*e
129 楼
你不懂女生。。。女生要的是一种安全感。。。一种男生可以为她付出的安全感。。。
帅又不能当饭吃。。。
当然有女生短视。。。有男生装大方。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 有的时候觉得有些女的不买那个包会死啊，花个几百买个包，我就是捐了也不买那种
: 马桶式的包。还有的，你别看贼美，有个长得贼丑的男的砸重金买了个包包，那女的
: 就跟他了，当然了，成了我们的饭后笑料。
帅又不能当饭吃。。。
当然有女生短视。。。有男生装大方。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 有的时候觉得有些女的不买那个包会死啊，花个几百买个包，我就是捐了也不买那种
: 马桶式的包。还有的，你别看贼美，有个长得贼丑的男的砸重金买了个包包，那女的
: 就跟他了，当然了，成了我们的饭后笑料。
A*e
130 楼
妖精啊，你不是都说了么？再加一个千变万化， ：）
【在 c********e 的大作中提到】
: 赞！对了，上次你还没回答我呢，你这个ID从哪冒出来的，怎么以前没见过你啊
【在 c********e 的大作中提到】
: 赞！对了，上次你还没回答我呢，你这个ID从哪冒出来的，怎么以前没见过你啊
c*e
131 楼
我经常在买买提上调戏美女的一句话就是，“老子倾家荡产去卖血卖苦力也要给你买包
包啊。。。”
【在 A******e 的大作中提到】
: 你不懂女生。。。女生要的是一种安全感。。。一种男生可以为她付出的安全感。。。
: 帅又不能当饭吃。。。
: 当然有女生短视。。。有男生装大方。。。
包啊。。。”
【在 A******e 的大作中提到】
: 你不懂女生。。。女生要的是一种安全感。。。一种男生可以为她付出的安全感。。。
: 帅又不能当饭吃。。。
: 当然有女生短视。。。有男生装大方。。。
c*e
132 楼
恩，不boring就好，有聊头
【在 A******e 的大作中提到】
: 妖精啊，你不是都说了么？再加一个千变万化， ：）
【在 A******e 的大作中提到】
: 妖精啊，你不是都说了么？再加一个千变万化， ：）
A*e
133 楼
明儿再调戏你吧，或者后天。。。太困了。。。脑子不动了。。。要呼呼了。。。
【在 c********e 的大作中提到】
: 恩，不boring就好，有聊头
【在 c********e 的大作中提到】
: 恩，不boring就好，有聊头
c*e
134 楼
你多高，美女身材都很好的，您不是矮冬瓜吧？
【在 A******e 的大作中提到】
: 妖精啊，你不是都说了么？再加一个千变万化， ：）
【在 A******e 的大作中提到】
: 妖精啊，你不是都说了么？再加一个千变万化， ：）
c*e
135 楼
恩，晚安
【在 A******e 的大作中提到】
: 明儿再调戏你吧，或者后天。。。太困了。。。脑子不动了。。。要呼呼了。。。
【在 A******e 的大作中提到】
: 明儿再调戏你吧，或者后天。。。太困了。。。脑子不动了。。。要呼呼了。。。
E*n
136 楼
悄悄奔给我一张当做福利:D
【在 A******e 的大作中提到】
: 那就当我奔过了哈
【在 A******e 的大作中提到】
: 那就当我奔过了哈
b*7
137 楼
大家居然有眼无珠， 大美女就在眼前都没人看 ？？
要看要看 ～～～
【在 A******e 的大作中提到】
: 谁来看？
要看要看 ～～～
【在 A******e 的大作中提到】
: 谁来看？
c*e
138 楼
bell007，可以认识一下么
【在 b*****7 的大作中提到】
: 大家居然有眼无珠， 大美女就在眼前都没人看 ？？
: 要看要看 ～～～
【在 b*****7 的大作中提到】
: 大家居然有眼无珠， 大美女就在眼前都没人看 ？？
: 要看要看 ～～～
A*e
139 楼
那你也悄悄奔给我一张，：）
【在 E*****n 的大作中提到】
: 悄悄奔给我一张当做福利:D
【在 E*****n 的大作中提到】
: 悄悄奔给我一张当做福利:D
A*e
140 楼
你是谁呀？这么抬举我？
【在 b*****7 的大作中提到】
: 大家居然有眼无珠， 大美女就在眼前都没人看 ？？
: 要看要看 ～～～
【在 b*****7 的大作中提到】
: 大家居然有眼无珠， 大美女就在眼前都没人看 ？？
: 要看要看 ～～～
A*e
141 楼
伊是谁？你给科普科普
【在 c********e 的大作中提到】
: bell007，可以认识一下么
【在 c********e 的大作中提到】
: bell007，可以认识一下么
E*n
142 楼
只要你不转发给别银就行。
来嘛，影雄~
【在 A******e 的大作中提到】
: 那你也悄悄奔给我一张，：）
来嘛，影雄~
【在 A******e 的大作中提到】
: 那你也悄悄奔给我一张，：）
A*e
143 楼
我从来不转不存。问题是怎么悄悄奔？
【在 E*****n 的大作中提到】
: 只要你不转发给别银就行。
: 来嘛，影雄~
【在 E*****n 的大作中提到】
: 只要你不转发给别银就行。
: 来嘛，影雄~
c*e
144 楼
Her other ID is diana2009
【在 A******e 的大作中提到】
: 伊是谁？你给科普科普
【在 A******e 的大作中提到】
: 伊是谁？你给科普科普
b*7
145 楼
who is diana2009 ?
【在 c********e 的大作中提到】
: Her other ID is diana2009
【在 c********e 的大作中提到】
: Her other ID is diana2009
A*e
146 楼
你认识我？
【在 b*****7 的大作中提到】
: who is diana2009 ?
【在 b*****7 的大作中提到】
: who is diana2009 ?
b*7
147 楼
不会吧 。。。
就是起哄而已
有奔，居然都没人看？！
【在 A******e 的大作中提到】
: 你认识我？
就是起哄而已
有奔，居然都没人看？！
【在 A******e 的大作中提到】
: 你认识我？
c*e
148 楼
我觉得看别人照片没什么意思
【在 b*****7 的大作中提到】
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
【在 b*****7 的大作中提到】
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
A*e
149 楼
哦，学到了 ^_^
不会吧 。。。
就是起哄而已
有奔，居然都没人看？！
【在 b*****7 的大作中提到】
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
不会吧 。。。
就是起哄而已
有奔，居然都没人看？！
【在 b*****7 的大作中提到】
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
c*e
150 楼
多想我，你藏哪去了？偶这两天都快难受死了，伐克这些焦头烂额的事情呀，一个人出
去看电影去了
【在 A******e 的大作中提到】
: 哦，学到了 ^_^
:
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
去看电影去了
【在 A******e 的大作中提到】
: 哦，学到了 ^_^
:
: 不会吧 。。。
: 就是起哄而已
: 有奔，居然都没人看？！
相关阅读
southern blot questionpaper help[bssd] 流水账：我在那战斗的7年里（3）which title is better哪个地方的cardiovascular／metabolic disease比较好？没有生物材料的版？求建议： tumor suppressor 基因身份问题？Osama Bin Laden is deadSea Urchin Meeting归来 【转自biowsnv.com】paper help, BAOZI新科NAS member？Paper HelpPh. D即将毕业，该回国去外企还是继续寻找postdoc说到图片作假，请看奥巴马的出生证明谁能帮我看看这是怎么回事， 谢谢啦！河南电视台昨天追踪报道肖氏手术著名病人爬行女孩小艳丽四年后近况弱弱地请教酶切问题！！！paper help打算转行了