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请教TA cloning的初级问题

请教TA cloning的初级问题# Biology - 生物学

d*82012-01-13 08:01

1 楼

【以下文字转载自 WaterWorld 讨论区】
发信人: yufengluo (yufeng), 信区: WaterWorld
标题: 国家统计局总经济师姚景源当之无愧啊:吃不起猪肉可以吃牛肉！
发信站: BBS 未名空间站 (Tue May 4 12:33:17 2010, 美东)
国家统计局总经济师姚景源当之无愧啊，在近日的某档经济类节目接受采访时，通篇胡
搅蛮缠，听了半天，只能大概听懂，反正有问题都是外国造成的，跟国家没关系，最经
典的是主持人问猪肉贵了我们吃不起怎么办？他说吃不起猪肉吃牛肉啊！绝对堪称经典
啊，记得上次说出这样经典语句的是晋惠帝：“百姓无栗米充饥,何不食肉糜?”
附录：
主持人：刚才还有一位现场的观众提出，他觉得现在肉价特别贵，猪肉的价格节节
高升，在肉价不断上涨的情况下，这位阿姨怎么过好她的日子？
姚景源：经济学上有一个替代原理，任何一种商品都有替代品，不管什么商品都有
替代品，所以商品本身依赖自身的使用价值，不可能形成垄断。比如说刚才那位同志讲
了，现在猪肉价格涨的太高，太厉害，怎么办呢？就说买它或者不买它。你买谁呢？买
它的替代品，就是涨幅不高

B*r2012-01-13 08:01

2 楼

TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
接？
用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。

b*e2012-01-13 08:01

3 楼

国内牛肉比猪肉便宜

【在 d*******8 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 WaterWorld 讨论区】
: 发信人: yufengluo (yufeng), 信区: WaterWorld
: 标题: 国家统计局总经济师姚景源当之无愧啊:吃不起猪肉可以吃牛肉！
: 发信站: BBS 未名空间站 (Tue May 4 12:33:17 2010, 美东)
: 国家统计局总经济师姚景源当之无愧啊，在近日的某档经济类节目接受采访时，通篇胡
: 搅蛮缠，听了半天，只能大概听懂，反正有问题都是外国造成的，跟国家没关系，最经
: 典的是主持人问猪肉贵了我们吃不起怎么办？他说吃不起猪肉吃牛肉啊！绝对堪称经典
: 啊，记得上次说出这样经典语句的是晋惠帝：“百姓无栗米充饥,何不食肉糜?”
: 附录：
: 主持人：刚才还有一位现场的观众提出，他觉得现在肉价特别贵，猪肉的价格节节

I*a2012-01-13 08:01

4 楼

3.5没有问题，
可以替代，
不用提高，
纯化肯定要好些，

l*k2012-01-13 08:01

5 楼

还是贵一些

【在 b*****e 的大作中提到】

: 国内牛肉比猪肉便宜

M*r2012-01-13 08:01

6 楼

我做过3kb的，效率比2kb以下的要下降很多....
建议用takara的LA taq+GC rich buffer （I orII），这个高保真酶会自己加A的，所
以省一步效果很不错的。

【在 B*********r 的大作中提到】

: TA cloning的insert片段长度上有什么限度吗？我的片断有大约3.5kb，会不会很难连
: 接？
: 用的是高保真酶，所以需要纯化后加A尾，用普通的的dNTP代替dATP是否可以？浓度是
: 等同普通PCR还是需要提高？加A尾后需要再次纯化吗？
: 对分子克隆不是很熟悉，非常感谢任何意见建议。

y*c2012-01-13 08:01

7 楼

买不起牛肉买水产品
更贵

r*y2012-01-13 08:01

8 楼

用invitrogen的XL TA kit

【在 B*********r 的大作中提到】

l*12012-01-13 08:01

9 楼

RE:
俺也参合一把
if GC rich >3kbp
first choice:
htp://www.clontech.com/FR/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR?sitex=10020:
22372:US#
htp://www.clontech.com/NO/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR/Long_PCR_and_GC
-Rich_PCR/Advantage_GC_2_DNA_Polymerase?sitex=10023:22372:US
then subcloning.

【在 r******y 的大作中提到】

: 用invitrogen的XL TA kit

B*r2012-01-13 08:01

10 楼

感谢诸位的意见！
本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
是case by case了吧。
PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢
唉，看来还是干实验比较轻松愉快，湿实验太揪心了。。。

l*12012-01-13 08:01

11 楼

RE:
not expensive blunt TOPO
but alternatively you can try
another ligation-anchored PCR protocol:
details just go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31517723.html
2F
from our experience even over 7.5kbp with a very longer 3' UTR mRNA (for
alternative splicing functions
possible) can be full cloned its ORF plus 5' UTR and near 3' UTR (3kbp)
then TA sub cloning
with TOPO TA kit:
htp://products.invitrogen.com/ivgn/product/K450001

Taq

【在 B*********r 的大作中提到】

: 感谢诸位的意见！
: 本来感觉TA cloning应该是很textbook的事情，结果就遇上了个棘手货，这事儿只能算
: 是case by case了吧。
: PCR条件是别人优化的，据说尝试了几种酶，只有Phusion HF能获得有效的扩增，可能
: 序列比较特别吧（但不算是GC rich），所以也不想再折腾PCR体系了。
: 之前尝试加A尾后不纯化直接连接，失败了，克隆很少，还都是空载体。中间还犯了个
: 低级错误，加A尾用了Hotstart Taq却没有变性直接上72度延伸（名字叫Platinum Taq
: ，后来仔细看说明书才知道是Hotstart）。
: 接下来只好尝试一下加A尾之后纯化再TA连接了，如果还是搞不定，就换blunt TOPO得
: 了，贵也没办法。有谁有平端PCR产物克隆的kit推荐吗，便宜点的，谢谢