BAC这种超大质粒转染试剂用什么# Biology - 生物学
c*k
1 楼
Engineer的postdoc了很长时间，混乐个GC
找了很长时间的工作。
感觉一般只能找到Start up的小公司。
感觉大公司很难进啊。
而且动不动就是要求10年8年的
经验
找了很长时间的工作。
感觉一般只能找到Start up的小公司。
感觉大公司很难进啊。
而且动不动就是要求10年8年的
经验
s*a
2 楼
个位可在回贴中
列出配置 和 价钱 本人已有显示器
当然还有联系方式
谢谢
列出配置 和 价钱 本人已有显示器
当然还有联系方式
谢谢
s*a
3 楼
有没有同志有经验？
J*n
4 楼
原来postdoc也是这个感受。。。
【在 c******k 的大作中提到】
: Engineer的postdoc了很长时间，混乐个GC
: 找了很长时间的工作。
: 感觉一般只能找到Start up的小公司。
: 感觉大公司很难进啊。
: 而且动不动就是要求10年8年的
: 经验
【在 c******k 的大作中提到】
: Engineer的postdoc了很长时间，混乐个GC
: 找了很长时间的工作。
: 感觉一般只能找到Start up的小公司。
: 感觉大公司很难进啊。
: 而且动不动就是要求10年8年的
: 经验
l*3
5 楼
正在玩crysis 2，感觉关键在显卡，我的GTX 460 SLI，200刀的卡（单卡或者双卡SLI/
CF），足矣。至于平台，配2500K的大众机型就可以了。
CF），足矣。至于平台，配2500K的大众机型就可以了。
s*s
6 楼
以前ms讨论过。我们用lipofectamin ltx
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
w*n
7 楼
弄反了
毕业之后先进大公司赚reputation和experience，比如investment bank
然后再去小一点的公司赚钱，比如hedge fund
【在 c******k 的大作中提到】
: Engineer的postdoc了很长时间，混乐个GC
: 找了很长时间的工作。
: 感觉一般只能找到Start up的小公司。
: 感觉大公司很难进啊。
: 而且动不动就是要求10年8年的
: 经验
毕业之后先进大公司赚reputation和experience，比如investment bank
然后再去小一点的公司赚钱，比如hedge fund
【在 c******k 的大作中提到】
: Engineer的postdoc了很长时间，混乐个GC
: 找了很长时间的工作。
: 感觉一般只能找到Start up的小公司。
: 感觉大公司很难进啊。
: 而且动不动就是要求10年8年的
: 经验
W*3
8 楼
XPS 8300 with ATI 5770, everything max out, you can get it below $700.
s*t
9 楼
不难的，跟转普通质粒差不多。
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
Lipofectamine 2000都可以的
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
详细的protocol，照着做就行了。
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
Lipofectamine 2000都可以的
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
详细的protocol，照着做就行了。
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
c*k
10 楼
关键是大公司不要咱们啊
【在 w*****n 的大作中提到】
: 弄反了
: 毕业之后先进大公司赚reputation和experience，比如investment bank
: 然后再去小一点的公司赚钱，比如hedge fund
【在 w*****n 的大作中提到】
: 弄反了
: 毕业之后先进大公司赚reputation和experience，比如investment bank
: 然后再去小一点的公司赚钱，比如hedge fund
l*g
11 楼
i7 2600k +gtx 460 se或
athlon 4200 +GS 8800, 均可流畅运行，把anti-alias 关掉，1920X1080没问题。
athlon 4200 +GS 8800, 均可流畅运行，把anti-alias 关掉，1920X1080没问题。
s*a
12 楼
谢谢两位
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
w*n
13 楼
继续努力
【在 c******k 的大作中提到】
: 关键是大公司不要咱们啊
【在 c******k 的大作中提到】
: 关键是大公司不要咱们啊
r*y
14 楼
does 2500k + 560 gti + 16gb memory good??
s*s
15 楼
，其实效率不重要，反正最后你多半挑克隆，有那么几个就行了
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
s*a
16 楼
实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
s*s
17 楼
确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*a
18 楼
问题是现在一个细胞也转不上:(
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
:
: 350
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
:
: 350
s*s
19 楼
你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
s*a
20 楼
非常好，80-90%，你没有仔细读我上面的帖子啊。
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
l*y
21 楼
1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*a
22 楼
Thanks! I would have a try on nucleofection.
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
:
: 350
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
:
: 350
h*y
23 楼
我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*t
24 楼
嗯 细胞密度重要
按楼上说的试试
按楼上说的试试
s*a
25 楼
有没有同志有经验？
s*s
26 楼
以前ms讨论过。我们用lipofectamin ltx
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
s*t
27 楼
不难的，跟转普通质粒差不多。
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
Lipofectamine 2000都可以的
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
详细的protocol，照着做就行了。
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
Lipofectamine 2000都可以的
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
详细的protocol，照着做就行了。
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
s*a
28 楼
谢谢两位
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
s*s
29 楼
，其实效率不重要，反正最后你多半挑克隆，有那么几个就行了
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
s*a
30 楼
实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
s*s
31 楼
确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*a
32 楼
问题是现在一个细胞也转不上:(
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
:
: 350
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
:
: 350
s*s
33 楼
你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
s*a
34 楼
非常好，80-90%，你没有仔细读我上面的帖子啊。
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
l*y
35 楼
1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*a
36 楼
Thanks! I would have a try on nucleofection.
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
:
: 350
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
:
: 350
h*y
37 楼
我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
s*t
38 楼
嗯 细胞密度重要
按楼上说的试试
按楼上说的试试
s*a
39 楼
不是typo，8-well Nunc plate，和ibidi差不多，做imaging用。
谢谢你的建议。
【在 h******y 的大作中提到】
: 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
: 。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
: 染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
: 有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
: 所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
: 常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
: PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
: 不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
: 另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
: 样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
谢谢你的建议。
【在 h******y 的大作中提到】
: 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
: 。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
: 染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
: 有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
: 所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
: 常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
: PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
: 不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
: 另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
: 样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
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