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clone大分子困难，跪求适合扩增大分子Taq酶

clone大分子困难，跪求适合扩增大分子Taq酶# Biology - 生物学

G*e2012-01-30 08:01

1 楼

【以下文字转载自 Military 讨论区】
发信人: stainlesscat (冰猫), 信区: Military
标题: 这个。。笑得不行了
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 9 21:18:50 2010, 美东)
http://www.youtube.com/watch?v=sv6D4sieaHM&feature=related
这运动很有魅力

s*32012-01-30 08:01

2 楼

别扯什么性价比
单论性能稳定性
是哪个呢？
e4200 v2怎么样

t*P2012-01-30 08:01

3 楼

非常大的分子7000bp，PCR不出来
是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
谁有经验，请指教啊

G*e2012-01-30 08:01

4 楼

贴不了视频了？

m*e2012-01-30 08:01

5 楼

E4300

【在 s******3 的大作中提到】

: 别扯什么性价比
: 单论性能稳定性
: 是哪个呢？
: e4200 v2怎么样

m*z2012-01-30 08:01

6 楼

还是分段P吧
反转这么大的效率很低

【在 t*****P 的大作中提到】

: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊

s*32012-01-30 08:01

7 楼

哪有4300 扯呢吧？

【在 m******e 的大作中提到】

: E4300

S*s2012-01-30 08:01

8 楼

从cDNA中clone一个6k的gene
Phusion号称可以，但效率仍然很低。
分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site.

【在 t*****P 的大作中提到】

: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊

m*n2012-01-30 08:01

9 楼

他说错了，是4500

【在 s******3 的大作中提到】

: 哪有4300 扯呢吧？

E*u2012-01-30 08:01

10 楼

两段p出来以后直接合一起用LA Taq overlapping PCR
不要搞silent mutation了

【在 S*********s 的大作中提到】

: 从cDNA中clone一个6k的gene
: Phusion号称可以，但效率仍然很低。
: 分了两段，每段3K左右，band非常清晰。
: 中间加个site,可以做silent mutation,增加可用的site.

t*t2012-01-30 08:01

11 楼

你是故事人的马甲么?

【在 s******3 的大作中提到】

: 别扯什么性价比
: 单论性能稳定性
: 是哪个呢？
: e4200 v2怎么样

T*y2012-01-30 08:01

12 楼

takara

s*32012-01-30 08:01

13 楼

他是谁啊

【在 t****t 的大作中提到】

: 你是故事人的马甲么?

m*y2012-01-30 08:01

14 楼

Roche的long template pcr kit 应该能搞的定，我p6点几kb的一次搞定，估计你的7kb
也压力不大，可以试一下

d*y2012-01-30 08:01

15 楼

phusion PCR

k*n2012-01-30 08:01

16 楼

phusion with dmso

s*s2012-01-30 08:01

17 楼

花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
如果是gDNA也就忍了

【在 t*****P 的大作中提到】

: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊

s*82012-01-30 08:01

18 楼

才用phusion P了一个5k的片段,测序了一个克隆,确实是一堆mutation.谁能告诉我为啥
?phusion不是号称high fidelity的么?

【在 s******s 的大作中提到】

: 花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
: 如果是gDNA也就忍了

s*82012-01-30 08:01

19 楼

这个overlapping PCR 怎么做?从来没做过,求科普

【在 E***u 的大作中提到】

: 两段p出来以后直接合一起用LA Taq overlapping PCR
: 不要搞silent mutation了

s*s2012-01-30 08:01

20 楼

商业宣传不能信啊，呵呵。主要是很多是polymorphism还有alternative
splicing, 也就是你的mRNA就是这样的。问题是你不知道哪些是这个，哪些
是pcr造成的

【在 s********8 的大作中提到】

: 才用phusion P了一个5k的片段,测序了一个克隆,确实是一堆mutation.谁能告诉我为啥
: ?phusion不是号称high fidelity的么?

l*12012-01-30 08:01

21 楼

LZ please try below (I) to (IV) four strands overlap PCR
your target 7kp=2kp(I)+2kp(II)+2kp(III)+1kp(IV)
if you did not know downstream any conservative sequence information
your 3' RACE can use ligation-anchored PCR
就是用内切酶
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
对应的人工引物锚定long mRNA 的3'端做人工锚定引物
i.e. by NotI it should be inserted to 3'端 5'GC---GGCCGC
from
//en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
Enzyme Source Recognition Sequence Cut
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
Reference:
1)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
2)
http://aem.asm.org/content/75/6/1552.abstract
3)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
from cost concern:
Takara Extra Taq is enough for above 2kp target
//www.clontech.com/takara/FR/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/Ex_Taq_DNA_Polymerase?
sitex=10031:22372:US
last if you try to take 7KP
please try this one
//www.clontech.com/takara/NO/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/LA_Taq_DNA_Polymerase?
sitex=10034:22372:US
if also high GC share
try this one:
//www.clontech.com/takara/NO/Products/PCR_Products/High_Performance_PCR/LA_Taq_DNA_Polymerase_
with_GC_Buffers?sitex=10034:22372:US

【在 t*****P 的大作中提到】

: 非常大的分子7000bp，PCR不出来
: 是因为反转录效率低，还是PCR效率低呢？
: 谁有经验，请指教啊

s*82012-01-30 08:01

22 楼

polymorphism不应该造成氨基酸序列改变吧?我说的mutation是引起aa变化的那些,数了
一下,大概每kb有一个这样的mutation.我还没有完全测序我的克隆,但是按这个概率的
话就会有4到5个mutation,这个克隆是做表达用的,不知道会不会有影响,郁闷.

【在 s******s 的大作中提到】

: 商业宣传不能信啊，呵呵。主要是很多是polymorphism还有alternative
: splicing, 也就是你的mRNA就是这样的。问题是你不知道哪些是这个，哪些
: 是pcr造成的