CoIP- mass spectrum 求助 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

CoIP- mass spectrum 求助

CoIP- mass spectrum 求助# Biology - 生物学

y*12012-03-06 08:03

1 楼

Location: Shanghai China
Company: Unilever
Major: Chemistry Materials and Related.
Masters and PHDs welcome.
Send resume or questions to l***********[email protected] if interested.
Thanks.

N*t2012-03-06 08:03

2 楼

给我的第一个offer
Get a $5 rebate from Offermatic when you purchase a Costco Membership
Certificate online only!
附近没有这货，信用卡也从来没刷过这货...

s*t2012-03-06 08:03

3 楼

小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子

C*R2012-03-06 08:03

4 楼

thanks:)

【在 y***1 的大作中提到】

: Location: Shanghai China
: Company: Unilever
: Major: Chemistry Materials and Related.
: Masters and PHDs welcome.
: Send resume or questions to l***********[email protected] if interested.
: Thanks.

b*i2012-03-06 08:03

5 楼

move on

s*t2012-03-06 08:03

6 楼

h*n2012-03-06 08:03

7 楼

same here, lol.

【在 N*********t 的大作中提到】

: 给我的第一个offer
: Get a $5 rebate from Offermatic when you purchase a Costco Membership
: Certificate online only!
: 附近没有这货，信用卡也从来没刷过这货...

a*c2012-03-06 08:03

8 楼

如果IP后bands很多，可能是lysate的微小的不溶性pellet沉淀的原因，同时也和
antibody特异性有关。可以这样改进，细胞lysate IP前，超高速离心15分钟，上清用
protein A beads preclear。在lysate里加一抗binding不要超过一小时。加protein A
beads前，先用5% BSA 将beads 在4度block一小时。

c*72012-03-06 08:03

9 楼

上个周的好，是amazon的。已经拿到

s*t2012-03-06 08:03

10 楼

非常感谢～你的建议很有用～
请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？

N*t2012-03-06 08:03

11 楼

这玩意现在是每周一个offer?

【在 c*********7 的大作中提到】

: 上个周的好，是amazon的。已经拿到

s*t2012-03-06 08:03

12 楼

350mM/甚至420/500 NaCl
0.1% NP-40
洗5遍

band？

【在 s*****t 的大作中提到】

: 非常感谢～你的建议很有用～
: 请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？

s*r2012-03-06 08:03

13 楼

没收到这个。。。每周收到的都是垃圾offer，直接move on

【在 c*********7 的大作中提到】

: 上个周的好，是amazon的。已经拿到

g*52012-03-06 08:03

14 楼

您能不能给给各完整的protocol？谢谢。

【在 s*********t 的大作中提到】

: 350mM/甚至420/500 NaCl
: 0.1% NP-40
: 洗5遍
:
: band？

s*g2012-03-06 08:03

15 楼

每个人的不一样
我今天也收到了
没兴趣升级我的membership

【在 N*********t 的大作中提到】

: 这玩意现在是每周一个offer?

g*52012-03-06 08:03

16 楼

我用的是sigma的flag resin，用flag peptide 洗脱的。
不过得到很多蛋白，后续IP没有验证出来...

band？

【在 s*****t 的大作中提到】

: 非常感谢～你的建议很有用～
: 请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？

d*y2012-03-06 08:03

17 楼

我也收到这个，直接pass了
话说我没有每周一个offer啊，一般都两周才有一个。。。大部分还都是鸡肋offer

s*t2012-03-06 08:03

18 楼

protocol一搜一大把呀找篇大文章method部分自己修改下就能用
M2 resin有几个常见的contamination
最好有个control对照一下
用agrose beads preclear一下也行不过不是必须的
盐浓度和detergent也比较重要

【在 g*********5 的大作中提到】

: 您能不能给给各完整的protocol？谢谢。

a*c2012-03-06 08:03

19 楼

我一直觉得，用更strigent的washing的办法，其实远不如在binding上下功夫摸索更好
的IP条件。我遇到过的一个真实例子是，我已经用含有SDS的RIPA buffer作为细胞裂解
和washing beads的buffer了，control IP那里仍有signal。最后采用缩短Antibody
binding的时间的办法，最后解决了这个问题。

g*52012-03-06 08:03

20 楼

据Invitrogen网站上的介绍，一些短暂结合的蛋白应该binding小于4个小时，甚至1.5
小时...

l*y2012-03-06 08:03

21 楼

the best way is metabolic isotopic labeling, then quantitative mass spec.

【在 s*****t 的大作中提到】

: 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
: 我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
: 然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
: 多谢~ 5个包子