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200文悬赏：Pulse-chase的替代方法

200文悬赏：Pulse-chase的替代方法# Biology - 生物学

a*x2012-04-14 07:04

1 楼

被reviewer要求用pulse-chase看一个endogenous cytosolic protein degradation。
我们没有S35的执照，做起来很烦。此外这个蛋白发现30年了，half life还是不清楚，
仅有的两篇做过它的pulse-chase，得到的条带也是上上下下，没有明确的half life。
想找替代方法。Biotin只能label膜蛋白。还想过用siRNA或者cycloheximide，但都觉
得不很理想。版上大牛有没有更好的方法，不吝指教，包子附上。如若成功，附赠多
次投CNS经验～

l*12012-04-14 07:04

2 楼

SILAC (Stable isotopic atoms for quantitative
mass spectrometry analysis)
Plus spatial proteomics eGFP/alternative biomarker labelling
details
please go to
original paper link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21937730
or
2011 one review:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21476986
To perform a system-wide analysis of
protein turnover
In human proteome:
cultured human cells. Protein abundance and
the rates of protein synthesis, degradation and turnover have
been measured in parallel for whole cells and for separate
cytoplasmic, nuclear and nucleolar compartments...
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31615903.html
------
ps: only Q-I-U B-A-O-Z-I
W-E-I B-I 200
please do not think more about your 多
That is okey for me.

s*y2012-04-14 07:04

3 楼

Cylcoheximide 是公认的最好的代替方法了，但是不知道你们为什么不用这个。
当然，使用的时候要小心注意两个方面：
1。浓度。我们一般直接用50~100ug/ml,比文献里面的高5倍，因为我们发现
大部分公司卖的cycloheximide 如果用10ug/ml 常常对于我们用的细胞系
没有作用。可能是我们用MEF不是那么喜欢吸收溶液里的东西。
2。添加方法：直接加到细胞原来的medium 里，千万不能加到一个新的medium
然后给细胞换液！！！！！因为换液之后会刺激细胞，导致做出来的曲线
千奇百怪。
另外一个方法就是lotkaeuler11提的SILAC了。不过这个我自己没有做过，就不
提建议了。

【在 a*****x 的大作中提到】

: 被reviewer要求用pulse-chase看一个endogenous cytosolic protein degradation。
: 我们没有S35的执照，做起来很烦。此外这个蛋白发现30年了，half life还是不清楚，
: 仅有的两篇做过它的pulse-chase，得到的条带也是上上下下，没有明确的half life。
: 想找替代方法。Biotin只能label膜蛋白。还想过用siRNA或者cycloheximide，但都觉
: 得不很理想。版上大牛有没有更好的方法，不吝指教，包子附上。如若成功，附赠多
: 次投CNS经验～

l*12012-04-14 07:04

4 楼

Continue:
SULAQ
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22106033
Proteomics. 2012 Jan;12(1):37-
Sulfur-36S stable isotope labeling of amino acids for quantification (SULAQ).
>Abstract
>We introduce a universal metabolic labeling strategy using elemental heavy
36Sulfur (36S) called 36Sulfur stable isotope labeling of amino acids for
quantification (SULAQ). In the proof of principle experiment, Pseudomonas
putida KT2440 was grown in defined minimal medium with sodium benzoate or
sodium succinate as the sole carbon and 32S- or 36S-sodium sulfate as the
sole sulfur sources. Quantification using mass spectrometry resulted in 562
proteins with 1991 unique peptides. SULAQ technology can be a valuable
alternative strategy for the quantitative comparisons in MS-based proteomics
approaches characterizing bacterial and other biological samples in
different growth conditions.

【在 l**********1 的大作中提到】

: SILAC (Stable isotopic atoms for quantitative
: mass spectrometry analysis)
: Plus spatial proteomics eGFP/alternative biomarker labelling
: details
: please go to
: original paper link:
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21937730
: or
: 2011 one review:
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21476986

a*x2012-04-14 07:04

5 楼

我们有做SILAC的facility，跟那个人谈过，他说我们目标蛋白没法做，他以前做过直
接的MS也做不出来（是个著名的难做蛋白，又会aggregate, 又有太多cleavage，还有
无数多修饰等。
不想用CHX因为这个蛋白虽然half life不清楚，但是基本肯定是slow turnover，大于
36小时。CHX treat我们的knockin cell line，cell吃不消。不过实在不行就做做试试。
此外你觉得如果siRNA 24小时内就knock-down 〉90%,而protein 24小时内只降低20%左
右，72小时后降低90%，那么可以默认转siRNA后24到72小时之间主要是protein 的
degradation吗？
包子随后附上

s*y2012-04-14 07:04

6 楼

啊，如果半衰期那么长的话就不能用cycloheximide 了。我们最长只能用9小时，
再长的话细胞就开始启动调亡程序了数据就没有意义了。
如果把mRNA 都搞掉了，的确可以默认主要是蛋白的降解。
所以这个也是一个方法。

试。

【在 a*****x 的大作中提到】

: 我们有做SILAC的facility，跟那个人谈过，他说我们目标蛋白没法做，他以前做过直
: 接的MS也做不出来（是个著名的难做蛋白，又会aggregate, 又有太多cleavage，还有
: 无数多修饰等。
: 不想用CHX因为这个蛋白虽然half life不清楚，但是基本肯定是slow turnover，大于
: 36小时。CHX treat我们的knockin cell line，cell吃不消。不过实在不行就做做试试。
: 此外你觉得如果siRNA 24小时内就knock-down 〉90%,而protein 24小时内只降低20%左
: 右，72小时后降低90%，那么可以默认转siRNA后24到72小时之间主要是protein 的
: degradation吗？
: 包子随后附上

l*12012-04-14 07:04

7 楼

BAOZIs Merci
寄信人: deliver (自动发信系统)
标题: 本站转帐通知单
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Apr 14 14:30:57 2012)
来源: mitbbs.com
lotkaeuler11,您好：
aardlbx 转给您,现金(伪币): 100 .
aardlbx

l*12012-04-14 07:04

8 楼

Bingo
plus if LZ lives near Boston
just go to PEGS Summit, Boston (April 30-May 4 2012)
web link:
//www.pegsummit.com/
Exhibit Floor Plan
(67) 8’x10’ Booths
(7) 6’x8’ Booths (A-G)
Floor Plan Subject to Change | Shaded Booths Reserved for Sponsors
16
NanoTemper Technologies GmbH
//www.pegsummit.com/PEGS_C11.aspx?id=94737&libID=94738
for viewing IN VIVO nano range protein interaction with its relatives.
//www.nanotemper-technologies.com/technology/microscale-thermophoresis/
article/background/
//www.nanotemper-technologies.com/technology/microscale-thermophoresis/
//www.nanotemper-technologies.com/technology/
more details please refer Z-H-A-N-N-E-I PM message...

【在 s******y 的大作中提到】

: 啊，如果半衰期那么长的话就不能用cycloheximide 了。我们最长只能用9小时，
: 再长的话细胞就开始启动调亡程序了数据就没有意义了。
: 如果把mRNA 都搞掉了，的确可以默认主要是蛋白的降解。
: 所以这个也是一个方法。
:
: 试。

l*12012-04-14 07:04

9 楼

Continue again:
YFP/GFP/Luciferase etc bioluminescence marker methods
for measurement of clearance rate constants within living cells
please refer
Science 2011 paper (YFP):
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233346
and 2012 paper (GFP) :
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22499809
Ps:
Below both figures were from 2012 Science paper its Supplementary Materials document,
web link:
//www.sciencemag.org/content/early/2012/04/11/science.1221920/suppl/DC1
Good Luck for your CNS revised version submission.

【在 l**********1 的大作中提到】

l*12012-04-14 07:04

10 楼

Continue lastly
GFP biomarker results:
cited from
//www.sciencemag.org/content/early/2012/04/11/science.1221920/suppl/DC1

Materials document,

【在 l**********1 的大作中提到】

: Continue again:
: YFP/GFP/Luciferase etc bioluminescence marker methods
: for measurement of clearance rate constants within living cells
: please refer
: Science 2011 paper (YFP):
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233346
: and 2012 paper (GFP) :
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22499809
: Ps:
: Below both figures were from 2012 Science paper its Supplementary Materials document,

a*x2012-04-14 07:04

11 楼

多谢！荧光的方法好像不行，因为被要求看Endogenous full length protein。否则我
们就用SNAP tag了。
至于第一个方法我研究一下。再次感谢两位大牛～

l*12012-04-14 07:04

12 楼

non c’est 牛 moi
Merci BAOZI ten:
寄信人: deliver (自动发信系统)
标题: 本站转帐通知单
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 15 08:35:50 2012)
来源: mitbbs.com
lotkaeuler11,您好：
aardlbx 转给您,现金(伪币): 100 .
aardlbx
----

【在 a*****x 的大作中提到】

: 多谢！荧光的方法好像不行，因为被要求看Endogenous full length protein。否则我
: 们就用SNAP tag了。
: 至于第一个方法我研究一下。再次感谢两位大牛～

l*12012-04-14 07:04

13 楼

站内PM aardlbx (活的潇洒) 了
注意保密啊天知地知你知偶知

【在 a*****x 的大作中提到】

: 多谢！荧光的方法好像不行，因为被要求看Endogenous full length protein。否则我
: 们就用SNAP tag了。
: 至于第一个方法我研究一下。再次感谢两位大牛～