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请大家推荐好的纯化hig-tag蛋白质的柱子
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请大家推荐好的纯化hig-tag蛋白质的柱子# Biology - 生物学
A*8
1
《悟空》和《老神仙》都是特别好的作品,而且限时创作出来的作品居然还那么成熟,
真的很厉害。
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r*t
2
嗯,制备级别的。
看着好多,不知道哪种比较好呢?
鞠躬,谢谢大家!
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s*y
3
搞不好平时的作品临时拿来了。哪能没有积累呢。 而且我真不觉得放松呼吸好在哪
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s*n
4
His-tag?
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i*t
5
限时创作作品 谁信啊!
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L*t
6
制备级别其实都差不多,国产的NiNTA用一两次效果不错但是再生后效率下降。Qiagen
的IDA树脂还有Clonetech的那个专有填料都还可以。不差钱就直接买GE的HisTrap(
NiNMPNBTA)或者Chelating Sepharose (IDA)。
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A*8
7
别人的作品也有可能是以前就创作好的。所以这个不能说明戴荃的创作不行。
我觉得《老神仙》没有《悟空》那么好听。但是《老神仙》也可以算是一个好的作品了。
仅仅凭《悟空》都可以赢。

【在 s*********y 的大作中提到】
: 搞不好平时的作品临时拿来了。哪能没有积累呢。 而且我真不觉得放松呼吸好在哪
: 。

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s*e
8
Talon背景干净,但是钴的亲和性低于镍。
Qiagen的NTA亲和能力强,但是杂带也会多一些。
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s*y
9
大家条件都是一样啊 我没说你家荃荃不行啊
粉丝有点理性好吗? 好赖话要看清楚。

了。

【在 A*******8 的大作中提到】
: 别人的作品也有可能是以前就创作好的。所以这个不能说明戴荃的创作不行。
: 我觉得《老神仙》没有《悟空》那么好听。但是《老神仙》也可以算是一个好的作品了。
: 仅仅凭《悟空》都可以赢。

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o*r
10
Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
specific binding

【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净,但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强,但是杂带也会多一些。

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w*k
11
你没说我们家荃荃最好就是原罪

【在 s*********y 的大作中提到】
: 大家条件都是一样啊 我没说你家荃荃不行啊
: 粉丝有点理性好吗? 好赖话要看清楚。
:
: 了。

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s*e
12
still worse background than Talon.

【在 o*****r 的大作中提到】
: Qiagen NTA, add 10-25 mM imidazole in the sample and buffer to reduce non-
: specific binding

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l*o
13
有点奇怪以前他参加中国好声音的时候并不是这个歌路,好像是R&B歌路的。不知道他
是近新年改了,还是为了迎合评委选的这种歌
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j*3
14
。。。。。
我的经验正好相反
GE的非常干净
talon一堆堆的杂带

【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净,但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强,但是杂带也会多一些。

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p*3
15
他给那个墨明棋妙做过不少歌

【在 l******o 的大作中提到】
: 有点奇怪以前他参加中国好声音的时候并不是这个歌路,好像是R&B歌路的。不知道他
: 是近新年改了,还是为了迎合评委选的这种歌

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C*e
16
+1
talon对有的his-tag蛋白不错
惊艳
有的就很烂很烂,杂带多,目标蛋白得率也低
不如Ni的对不同蛋白的performance相对稳定

【在 j******3 的大作中提到】
: 。。。。。
: 我的经验正好相反
: GE的非常干净
: talon一堆堆的杂带

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j*n
17
墨明棋妙出过不少好歌,除了戴,其他成员为什么不上节目?都低调么

【在 p*********3 的大作中提到】
: 他给那个墨明棋妙做过不少歌
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j*3
18
而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
洗脱液浓度范围不如ni大
梯度拉不开

【在 C*******e 的大作中提到】
: +1
: talon对有的his-tag蛋白不错
: 惊艳
: 有的就很烂很烂,杂带多,目标蛋白得率也低
: 不如Ni的对不同蛋白的performance相对稳定

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p*3
19
不知道,觉得他们那路歌不咋地。戴荃如果就直接拿那种风格的上节目也够呛。

【在 j******n 的大作中提到】
: 墨明棋妙出过不少好歌,除了戴,其他成员为什么不上节目?都低调么
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C*e
20
是滴
所以现在我还是换回用ni柱

【在 j******3 的大作中提到】
: 而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
: 洗脱液浓度范围不如ni大
: 梯度拉不开

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s*n
21
不知道LZ的制备级是指多大量?其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
我以前一直是GE的忠实用户,整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了,他
家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns,nickle和cobalt都有,都很方便。最大
的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg,Co柱子能到
30 mg.Co柱子非常好,我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶,全部成功。
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c*r
22
Pierce的用着很不错。
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z*8
23

特別同意這個,我覺得talon特別好用,純化後跑膠太乾淨了。

【在 s*******e 的大作中提到】
: Talon背景干净,但是钴的亲和性低于镍。
: Qiagen的NTA亲和能力强,但是杂带也会多一些。

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s*e
24
从上面回复看得出来,提蛋白这个事儿真的是千江有水千江月
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V*3
25
用centrifuged column 你无法用buffer gradient吧?
莫非就来几个step 就完了?

【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量?其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户,整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了,他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns,nickle和cobalt都有,都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg,Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好,我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶,全部成功。

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r*t
26

嗯,mg级别,不需要做结晶那么多,nmr量足矣。
不过就是要纯。
另外是否那种spin column 不太容易弄得很纯?

【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量?其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户,整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了,他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns,nickle和cobalt都有,都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg,Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好,我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶,全部成功。

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r*t
27

请问怎么optimize条件啊?
汗,啥叫梯度拉不开?
另外就是一般重力过柱子,还是灌柱后用fplc?

【在 j******3 的大作中提到】
: 而且talon还有个问题就是optimize起来比较困难
: 洗脱液浓度范围不如ni大
: 梯度拉不开

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s*n
28
难道你觉得做结晶的不需要很纯?

【在 r******t 的大作中提到】
:
: 请问怎么optimize条件啊?
: 汗,啥叫梯度拉不开?
: 另外就是一般重力过柱子,还是灌柱后用fplc?

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s*e
29
不需要,真的不需要 >80%就可以了

【在 s********n 的大作中提到】
: 难道你觉得做结晶的不需要很纯?
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s*n
30
OK,那是你的经验。
我是一定要>90%的

【在 s*******e 的大作中提到】
: 不需要,真的不需要 >80%就可以了
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s*e
31
真的是一个蛋白一个样,我有纯到逆天就是不长晶体的,也有边elute边出沉淀结果能
过1.5A的。

【在 s********n 的大作中提到】
: OK,那是你的经验。
: 我是一定要>90%的

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p*e
32
Macherey-Nagel(Qiagen和Clontech的核酸纯化技术均来自该公司)也进入了His-tag纯
化领域。他们提供不同亲和力的镍柱:Ni-IDA, Ni-NTA, Ni-TED。介质可以选择Silica
或Agarose.Silica Resin的结合非特异蛋白要比琼脂糖少很多。有AKTA兼容的标准1ml
和5ml柱,也有靠重力自主驱动的柱子。质量很好,价格比GE要低不少。大家可以从MN
直接买:http://www.mn-net.com/Products/Proteinpurification/PurificationofHistagproteins/tabid/1448/language/en-US/Default.aspx
也可以从我这里买,享受15%折扣。如果需要免费样品一试,我们很乐意提供。到我们
的网站给我们发信。
http://www.speedbiosystems.com/Protino_Products.aspx
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s*e
33
你们在Fisher里面吗?

Silica
1ml
MN

【在 p********e 的大作中提到】
: Macherey-Nagel(Qiagen和Clontech的核酸纯化技术均来自该公司)也进入了His-tag纯
: 化领域。他们提供不同亲和力的镍柱:Ni-IDA, Ni-NTA, Ni-TED。介质可以选择Silica
: 或Agarose.Silica Resin的结合非特异蛋白要比琼脂糖少很多。有AKTA兼容的标准1ml
: 和5ml柱,也有靠重力自主驱动的柱子。质量很好,价格比GE要低不少。大家可以从MN
: 直接买:http://www.mn-net.com/Products/Proteinpurification/PurificationofHistagproteins/tabid/1448/language/en-US/Default.aspx
: 也可以从我这里买,享受15%折扣。如果需要免费样品一试,我们很乐意提供。到我们
: 的网站给我们发信。
: http://www.speedbiosystems.com/Protino_Products.aspx

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j*3
34
一个是binding时候里面imidazole的浓度
洗脱的时候从binding浓度洗脱,50往上做梯度,直到500
然后page,看哪些浓度出来条带
收集洗脱液,浓缩

【在 r******t 的大作中提到】
:
: 请问怎么optimize条件啊?
: 汗,啥叫梯度拉不开?
: 另外就是一般重力过柱子,还是灌柱后用fplc?

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p*e
35

不在。我们本身就是一个小一些的Fisher。

【在 s*******e 的大作中提到】
: 你们在Fisher里面吗?
:
: Silica
: 1ml
: MN

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s*n
36
你这些都是普遍情况?个例拿出来说没有什么意思。

【在 s*******e 的大作中提到】
: 真的是一个蛋白一个样,我有纯到逆天就是不长晶体的,也有边elute边出沉淀结果能
: 过1.5A的。

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L*t
37
我习惯用IDA挂Zn纯化His,果然是少数派么。
一次纯化多个蛋白其实也不一定要用spin column, 用Pharmacia P-3之类的三道蠕动泵
也可以
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s*e
38
话是没错,可是在这个领域面前,谁手里的情况又不是个例呢?不积累个例又怎么能知
道普遍情况呢?

【在 s********n 的大作中提到】
: 你这些都是普遍情况?个例拿出来说没有什么意思。
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C*e
39
+1
所以说蛋白结晶这个事情不是个science而是"art"捏

【在 s*******e 的大作中提到】
: 真的是一个蛋白一个样,我有纯到逆天就是不长晶体的,也有边elute边出沉淀结果能
: 过1.5A的。

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r*t
40
谢谢指导,我再问一下:
请问可以recover这个柱子吗?还是一次性的?
貌似这pierce的柱子不便宜啊~~~

【在 s********n 的大作中提到】
: 不知道LZ的制备级是指多大量?其实一般3-5ml的柱子就能解决大部分需求了。
: 我以前一直是GE的忠实用户,整天在ATKA上折腾。现在我全面转向Pierce的柱子了,他
: 家有0.2, 1 and 3 ml的centrifuged columns,nickle和cobalt都有,都很方便。最大
: 的优点是可以同时纯化多个蛋白。3 ml的Ni柱子理论可以纯化到>100 mg,Co柱子能到
: 30 mg.Co柱子非常好,我已经用它一步纯化超过5个蛋白做结晶,全部成功。

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s*n
41
这些柱子都是可以regenerate的,你可以看看manual,里面建议是用low pH(5.0),
我觉得也可以用EDTA然后recharge。不过我一般都是一个柱子用在同一个蛋白上。
价格我没有比较所以不是很清楚,不过很方便,看你如何取舍了。如果你需要的量不大
,可以试试1 ml的,纯化个十几mg应该没问题。
GE还有一种柱子是gravity的,也很方便,可以同时操作几个柱子,好像效果也不错,
不过估计也不便宜。

【在 r******t 的大作中提到】
: 谢谢指导,我再问一下:
: 请问可以recover这个柱子吗?还是一次性的?
: 貌似这pierce的柱子不便宜啊~~~

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s*n
42
所以要看普遍情况,大部分成功的例子都是纯度比较高(>90%),当然的说的例子我也
听说过,所以一般而言纯度是必要而非充分条件。

【在 s*******e 的大作中提到】
: 话是没错,可是在这个领域面前,谁手里的情况又不是个例呢?不积累个例又怎么能知
: 道普遍情况呢?

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s*r
43
搭车问问,现在纯化这种重组蛋白,是不是一步就能到90%纯。

所以要看普遍情况,大部分成功的例子都是纯度比较高(>90%),当然的说的例子我也
听说过,所以一般而言纯度是必要而非充分条件。

【在 s********n 的大作中提到】
: 所以要看普遍情况,大部分成功的例子都是纯度比较高(>90%),当然的说的例子我也
: 听说过,所以一般而言纯度是必要而非充分条件。

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s*e
44
说句玩笑话,这个问题的答案永远是case by case。如果你的蛋白表达量很高(>mg/
Liter)是有可能的,但是一般都需要在亲和洗脱后加一步分子筛或离子交换进一步纯
化一下才能达到90%。如果你在蛋白质和亲和标签之间加了特异性蛋白酶(TEV,
FactorXa之类的)位点的话,可以考虑上柱之后用蛋白酶切下蛋白而非洗脱,这种情况
一般比洗脱得到的蛋白纯度高(因为相当于针对标签和酶切识别序列进行了双重纯化)
,但要小心有的蛋白结合亲和柱后对蛋白酶有抗性的情况。

【在 s******r 的大作中提到】
: 搭车问问,现在纯化这种重组蛋白,是不是一步就能到90%纯。
:
: 所以要看普遍情况,大部分成功的例子都是纯度比较高(>90%),当然的说的例子我也
: 听说过,所以一般而言纯度是必要而非充分条件。

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s*n
45
LS基本上已经回答你了。
我的经验(5个不同蛋白,都是N-terminal 6xHis tag)是通过Co-NTA spin columns一
步就得到>90%的蛋白(当然还要做buffer exchange),其中一些蛋白Ni-NTA也行。你
可以试试,但不能保证在你的蛋白上也一定work。

【在 s******r 的大作中提到】
: 搭车问问,现在纯化这种重组蛋白,是不是一步就能到90%纯。
:
: 所以要看普遍情况,大部分成功的例子都是纯度比较高(>90%),当然的说的例子我也
: 听说过,所以一般而言纯度是必要而非充分条件。

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