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EGFP免疫荧光固定？

EGFP免疫荧光固定？# Biology - 生物学

c*y2012-05-16 07:05

1 楼

一个人带着15个月23磅，会走路的娃回国，直飞。
主要问一下睡觉问题：
1。continental的飞机，可以提前要球座位吗？还是上了飞机等着空姐看着那里有空位
，再给调阿？
2。可以要球第一排座位，然后让娃睡在那块空地上吗？是睡在地上好呢还是睡在两个
座位上好呢？

z*f2012-05-16 07:05

2 楼

需要用一个软件，只有32位的，也只32位的系统才能安装。不知道有必要上很好的cpu
吗?显卡太好是不是也没必要啊？谢谢达人指导。

f*f2012-05-16 07:05

3 楼

单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
是否还能标记出来？

y*n2012-05-16 07:05

4 楼

如果想要bulk head，那只能当天去机场要，先到先得．睡觉一般不会让小孩睡地上，
因为太不安全，醒着坐在地上玩是可以的．如果小孩平时在哪儿都能睡，可能是俩座位
好一些，因为可以睡．如果敏感点，估计要抱一路．不管bulk head或俩普通座位都行
，一个普通座位估计就不行了，不光是小孩没地方睡，还有闹人和玩的时候影响旁边的
人的问题．

【在 c********y 的大作中提到】

: 一个人带着15个月23磅，会走路的娃回国，直飞。
: 主要问一下睡觉问题：
: 1。continental的飞机，可以提前要球座位吗？还是上了飞机等着空姐看着那里有空位
: ，再给调阿？
: 2。可以要球第一排座位，然后让娃睡在那块空地上吗？是睡在地上好呢还是睡在两个
: 座位上好呢？

T*n2012-05-16 07:05

5 楼

连是什么软件都不说，这问题问的。一般软件的话，搞个虚拟机好了。

cpu

【在 z**f 的大作中提到】

: 需要用一个软件，只有32位的，也只32位的系统才能安装。不知道有必要上很好的cpu
: 吗?显卡太好是不是也没必要啊？谢谢达人指导。

s*y2012-05-16 07:05

6 楼

Methanol 使得大部分蛋白变性了所以没有荧光了。用抗体还是能够标记出来的

【在 f*****f 的大作中提到】

: 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
: 常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
: 是否还能标记出来？

c*y2012-05-16 07:05

7 楼

谢谢回复。

【在 y****n 的大作中提到】

: 如果想要bulk head，那只能当天去机场要，先到先得．睡觉一般不会让小孩睡地上，
: 因为太不安全，醒着坐在地上玩是可以的．如果小孩平时在哪儿都能睡，可能是俩座位
: 好一些，因为可以睡．如果敏感点，估计要抱一路．不管bulk head或俩普通座位都行
: ，一个普通座位估计就不行了，不光是小孩没地方睡，还有闹人和玩的时候影响旁边的
: 人的问题．

c*n2012-05-16 07:05

8 楼

双核intel的。G系列应该就够 or i3

b*s2012-05-16 07:05

9 楼

固定剂的选择应当跟你的实验目的结合。methonal会使得蛋白变性而PFA只是可逆性得
交联蛋白。GFP变性了当然就看不到荧光了。用抗体应该还是可以看到荧光的，但是作
为细胞内蛋白的定位，还是应当用PFA。methonal对整个细胞的extraction太大，而且
会使核酸和蛋白发生聚集沉淀。
可能会有artifacts。所以ethonal和methonal只适用于组织形态学的实验。

【在 f*****f 的大作中提到】

z*f2012-05-16 07:05

10 楼

不好意思，是solidworks，虚拟机显存太少，运行的不好。

【在 T****n 的大作中提到】

: 连是什么软件都不说，这问题问的。一般软件的话，搞个虚拟机好了。
:
: cpu

m*u2012-05-16 07:05

11 楼

我用flow cytometry 测核内transcription factor就得用methanol处理。同时想看细
胞YFP荧光基本上就不可能了。如果哪个大虾有合适的protocol,不淬灭YFP,同时又能标
记上transcription factor的，麻烦提供一下。包子酬谢。有好的flow cytometry 用
的抗YFP荧光抗体，能标记上methanol处理过的细胞的也行。

【在 b******s 的大作中提到】

: 固定剂的选择应当跟你的实验目的结合。methonal会使得蛋白变性而PFA只是可逆性得
: 交联蛋白。GFP变性了当然就看不到荧光了。用抗体应该还是可以看到荧光的，但是作
: 为细胞内蛋白的定位，还是应当用PFA。methonal对整个细胞的extraction太大，而且
: 会使核酸和蛋白发生聚集沉淀。
: 可能会有artifacts。所以ethonal和methonal只适用于组织形态学的实验。

z*f2012-05-16 07:05

12 楼

谢谢。

【在 c********n 的大作中提到】

: 双核intel的。G系列应该就够 or i3

P*o2012-05-16 07:05

13 楼

We first fix GFP with 2% formaldehyde, followed by transcription factor
staining. This works for a bunch of TFs at our hands, but not sure whether
it will work for your case.

【在 m*****u 的大作中提到】

: 我用flow cytometry 测核内transcription factor就得用methanol处理。同时想看细
: 胞YFP荧光基本上就不可能了。如果哪个大虾有合适的protocol,不淬灭YFP,同时又能标
: 记上transcription factor的，麻烦提供一下。包子酬谢。有好的flow cytometry 用
: 的抗YFP荧光抗体，能标记上methanol处理过的细胞的也行。

c*n2012-05-16 07:05

14 楼

不过你要知道。。。32bit只能run 4gb不到的内存。。。。这适合不适合你用

【在 z**f 的大作中提到】

: 谢谢。

w*r2012-05-16 07:05

15 楼

你的实验可以用PFA固定么？
我之前用PFA处理细胞，加入PFA之后在显微镜下看，可以很清楚的看到GFP的信号就没
有了，
但是去掉PFA之后用PBS泡着，慢慢的GFP的信号就又恢复了，
挺好玩的，就像关灯开灯一样

z*f2012-05-16 07:05

16 楼

这个知道，但是这个软件天天要用，没办法。

【在 c********n 的大作中提到】

:
: 不过你要知道。。。32bit只能run 4gb不到的内存。。。。这适合不适合你用

f*f2012-05-16 07:05

17 楼

谢谢。不过很多GFP偶联的蛋白用Methanol 固定后荧光信号/定位好像并不会消失？

【在 s******y 的大作中提到】

: Methanol 使得大部分蛋白变性了所以没有荧光了。用抗体还是能够标记出来的

c*n2012-05-16 07:05

18 楼

跟我情况很相似。。我要用一个音乐软件。。。很多插件只能XP...最后。。。只能两
台电脑

【在 z**f 的大作中提到】

: 这个知道，但是这个软件天天要用，没办法。

f*f2012-05-16 07:05

19 楼

我倒没有直接在显微镜下看PFA影响，不过一般PFA 固定后用PBS洗后直接封片或IF标记
其它蛋白，荧光倒很正常

【在 w********r 的大作中提到】

: 你的实验可以用PFA固定么？
: 我之前用PFA处理细胞，加入PFA之后在显微镜下看，可以很清楚的看到GFP的信号就没
: 有了，
: 但是去掉PFA之后用PBS泡着，慢慢的GFP的信号就又恢复了，
: 挺好玩的，就像关灯开灯一样

e*e2012-05-16 07:05

20 楼

上好机器+虚拟机

cpu

【在 z**f 的大作中提到】

: 需要用一个软件，只有32位的，也只32位的系统才能安装。不知道有必要上很好的cpu
: 吗?显卡太好是不是也没必要啊？谢谢达人指导。

s*y2012-05-16 07:05

21 楼

大部分都会明显减弱，但是还是能勉强看见的，
如果看不见了那可能是你的蛋白表达量本来就不高。

【在 f*****f 的大作中提到】

: 谢谢。不过很多GFP偶联的蛋白用Methanol 固定后荧光信号/定位好像并不会消失？

z*f2012-05-16 07:05

22 楼

谢谢，我现在有用一台w520, 试了虚拟机，主机上的显卡没法给虚拟机用，所以使用效
果不好。

【在 e*****e 的大作中提到】

: 上好机器+虚拟机
:
: cpu

m*u2012-05-16 07:05

23 楼

Thanks. I'll try. I used 4% formaldehyde treatment before TF staining. But the signal stil gone. Seems fixation/perm time is tricky

【在 P****o 的大作中提到】

: We first fix GFP with 2% formaldehyde, followed by transcription factor
: staining. This works for a bunch of TFs at our hands, but not sure whether
: it will work for your case.

x*42012-05-16 07:05

24 楼

难道楼主不知道solidworks有64位版本吗？32位的最大只能分配2g内存给这软件，当然
用64bit版的啦。不明白为何要32的

【在 z**f 的大作中提到】

: 不好意思，是solidworks，虚拟机显存太少，运行的不好。

z*f2012-05-16 07:05

25 楼

64位破解的不好用啊，老出问题。

【在 x******4 的大作中提到】

:
: 难道楼主不知道solidworks有64位版本吗？32位的最大只能分配2g内存给这软件，当然
: 用64bit版的啦。不明白为何要32的