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求教Lentivirus shRNA knock-down实验

求教Lentivirus shRNA knock-down实验# Biology - 生物学

J*n2013-03-06 08:03

1 楼

【以下文字转载自 Sex 讨论区】
发信人: maozexi (愤怒的毛泽西), 信区: Sex
标题: 老新闻--阿娇及千名基督徒反婚前性行为
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Nov 4 01:32:07 2010, 美东)
阿娇及千名基督徒反婚前性行为
2006年9月3日
【明报专讯】女艺人“阿娇”钟欣桐遭偷拍更衣照余波未了，阿娇及
近千名基督徒
昨日齐集尖沙嘴文化中心广场，高呼：“壹本便利No Way、偷拍更衣No
Way”口号，谴
责偷拍行为，呼吁罢买《壹本便利》，及避免接触不雅资讯，有参与活动
的中学校长称
，会将偷拍事件作为教材，教导学生尊重别人。
阿娇及近千名基督徒昨出席由大卫城文化中心主办的“贞洁校园开学
礼”，除谴责
偷拍事件，亦呼吁学生拒绝婚前性行为，中文大学社会学系二年级生
Cheryl表示，过去
母亲曾购买《壹本便利》，但事件发生后，全家一致认为，若贪一时“眼
欲”便会助长
歪风，遂决定罢买该杂志。..............

d*i2013-03-06 08:03

2 楼

大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
efficiency变差了。
有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！

c*e2013-03-06 08:03

3 楼

不错，呵呵

【在 J****n 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Sex 讨论区】
: 发信人: maozexi (愤怒的毛泽西), 信区: Sex
: 标题: 老新闻--阿娇及千名基督徒反婚前性行为
: 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Nov 4 01:32:07 2010, 美东)
: 阿娇及千名基督徒反婚前性行为
: 2006年9月3日
: 【明报专讯】女艺人“阿娇”钟欣桐遭偷拍更衣照余波未了，阿娇及
: 近千名基督徒
: 昨日齐集尖沙嘴文化中心广场，高呼：“壹本便利No Way、偷拍更衣No
: Way”口号，谴

r*e2013-03-06 08:03

4 楼

这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
要解决只能挑克隆了。

【在 d*****i 的大作中提到】

: 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
: 第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
: efficiency变差了。
: 有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
: efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
: 有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！

r*g2013-03-06 08:03

5 楼

就和joke版是学术版一样，虚伪。

d*i2013-03-06 08:03

6 楼

如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧

【在 r***e 的大作中提到】

: 这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
: 可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
: 要解决只能挑克隆了。

a*e2013-03-06 08:03

7 楼

又来为阿娇和陈盥洗复出造势。你要是不提，我早把他们忘了

s*s2013-03-06 08:03

8 楼

应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统

【在 d*****i 的大作中提到】

: 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧

p*w2013-03-06 08:03

9 楼

哈哈

【在 J****n 的大作中提到】

a*a2013-03-06 08:03

10 楼

有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。

r*e2013-03-06 08:03

11 楼

作用不大，但是有可能enrich multiple copy integration。
一个细胞感染多个病毒。但是shRNA和puro表达量不一定线性。

【在 d*****i 的大作中提到】

: 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧

r*e2013-03-06 08:03

12 楼

这个一般是因为transfection进去的质粒多，infection病毒比较少。

【在 a********a 的大作中提到】

: 有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
: 没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。

a*a2013-03-06 08:03

13 楼

这个很常见, 如果KD后抑制生长就会这样
解决方法是快点做完,每次用新鲜感染的.

【在 d*****i 的大作中提到】

p*e2013-03-06 08:03

14 楼

That's normal, To most of knockdowns, the efficiency decreases with passages
. usually, after 20 passages, the knockdown is terrible.

【在 d*****i 的大作中提到】

q*g2013-03-06 08:03

15 楼

我一般做完transduction后，马上冻上一批。等knockdown不好的时候,就再拿出来用新
的.效果还不错.

d*i2013-03-06 08:03

16 楼

请教大牛具体解释下T2A和inducible的系统？？

【在 s******s 的大作中提到】

: 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
: 这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
: 细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
: 因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统

S*s2013-03-06 08:03

17 楼

T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable cell可以FACS sorting, or diulte to get single clone,看看
single clone的knockdown efficiency.
如果是对生长有影响的话，弄成单克隆之后应该就没问题了。
Good luck!

【在 d*****i 的大作中提到】

: 请教大牛具体解释下T2A和inducible的系统？？

d*i2013-03-06 08:03

18 楼

谢谢~
我现在用的是pKLO.1，没有连GFP，所以没法做FACS。。。
不知最早都是怎么注意到KD和生长速度有关？culture时观察发现的？

R.

【在 S*********s 的大作中提到】

: T2A
: your-gene-T2A site-puro
: 在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
: google
: The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
: site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
: sequences
: inducible system
: 请参考
: Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.