Promoter克隆，我的做法是这样，大家看看对不对 - 未名空间MITBBS历史存档

Promoter克隆，我的做法是这样，大家看看对不对# Biology - 生物学

m*m2013-05-02 07:05

1 楼

请教各位faculty，你们心目中自己的PhD学生和薄厚地位如何？
见到很多老板和自己的薄厚关系很好，通力合作搞研究。有很多faculty在薄厚期间做
出很多好工作。可是也见到这种老板：
拼死拼活尽心尽力带PhD学生，觉得那是自己人，希望他们做得好出好文章同时也为自
己争光。但对薄厚就是希望你利用自己原有的背景做东西，能少教尽量少教你，最好啥
也不教你你能自己出文章。可是有时候不教薄厚出文章也会很慢，老板不觉得自己雇薄
厚的钱白花了么？如果好好带薄厚效率本来可以更高的。还有的老板喜欢和自己的学生
在背后说薄厚坏话，某些事情喜欢只和学生交流，将薄厚排除在外，只是什么心理？怕
薄厚以后独立了和自己抢饭碗么？那为啥招花钱招薄厚，只招学生不就好了？

x*s2013-05-02 07:05

2 楼

1.秦朝是我国第一个SheHuiZhuYi国家。
2.对中国男人来说，没有房子，掏出的JJ都是软的。
3.发改委成立至今只做过两件事：1.涨价，2.替涨价辩护！
4.改革开放三十年，中国崛起的只有女人的屁股！
6.世界上最遥远的距离，不是天涯海角，也不是生死别离，而是我身在祖国，却不
知道祖国发生了什么事。
7.做互联网的人一定会遇到三个无法回避的问题：生、死、腾讯。
8.目前中国有效的反腐手段有：1.夫妻反目；2.家中被盗；3.意外事故；4.情人举
报；5.网民诅咒！
9.生完孩子没给红包，猜一名人——缝小刚。
10.公务员面试，问：平时爱看什么书？答：雷锋日记。
问：背一段听听。答：谭善芳开车把我拉到她家，和她做了3次……
11.日本明治公司郑重警告：截至今年8月份，中国淘宝网的明治奶粉销量已突破公
司1-8月的全球产量！
13.中国人不解地问蒙古人：“你们有没有海，为什么还要成立海军？”蒙古人说
：“你们中国不也有文化部吗？”
14.《台湾保钓人士成功出海，官方派军舰全程护航》——妈的！这么多年了，国
军还是正面战场！
15.外国蓝领的工资跟白领的一般高，这件事传到国内让工人知道了，工人就集体
到中南海门口抗议工资太低，领导出来拍胸脯保证以后工人的工资能和白领一样高。经
过政府十年努力，现在大学生的工资的确和民工一样高了～
16.人体肠道内的面积超过200平方米，而我们住的还不到20平方米，所以——我们
还不如一坨屎！
17.敏感词屏蔽的社会，路遇熟人：“你懂的！”熟人：“你也懂的～”互相点点
头，然后继续散步……
18.国外奶粉热销中国的原因：1.没有三聚氰胺；2.如果有可以索赔巨款；3.如果
索赔不成不会进监狱。
19.采访一名广东养猪专业户，该大叔将一盘光碟放入机器中，凤凰传奇的神曲响
起，“在你的心上，自由的飞翔~”
主持人：为什么要放这首音乐？
专业户：因为这样的音乐是放给猪听的！
20.千万别惹姓孙的——
今年，上海“钓鱼执法”惹了孙中界，结果……
数年前，广州收容所打死了孙志刚，结果……
数十年前，前苏联在珍宝岛惹了孙玉国，结果……
约八十年前，满清皇室后人惹了孙殿英，结果……
一百年前，清王朝惹了孙中山，结果……
一千多年前的三国时代，曹操惹了孙权，结果……
两千多年前的战国时代，庞涓惹了孙膑，结果……
两千多年前的春秋时代，吴王的爱姬惹了孙武，结果……
很久很久以前，玉皇大帝惹了孙悟空，结果……
21.近来每到深夜，许多领导的办公室火光熊熊，打119报警，消防无动于衷，拒
不出警，民众得到的答复是：领导们在烧日记！
22.甲借身体强壮揍了乙一顿，乙忍气吞声，晚上跑到甲家的墙上写了一个大大的
“拆”字。第二天一早，甲全家都死了……
23.上海对北京说：“盛会过后烧栋楼也算是我们的老传统了～”北京点点头，然
后和上海一起默默地看着广州……
24.韩国不能够把自己的卫星送到预定轨道，中国也不能够把自己的男足送到世界
杯，家家有本难念的经……
25.有人从厦门跳下水，一路狂游，到对岸后大呼“国民党万岁！”这时警察过来
拍着他的肩膀说“：同志，没来过鼓浪屿吧？”
26.朋友，你沮丧吗，你压抑吗，你缺乏自信吗？请立即订购一份《环球时报》，
把里面的“中国”替换为“我”，包你五分钟内自信心爆棚，徒手敢撬原子弹，马步能
阻七十码！
27.长沙市民日前在接受电台采访时反映，长沙税务局爆炸后，不仅税务局人员态
度好了，其他部门工作人员，如工商、街道、城管人员的态度都好多了……
28.以后春运买不到火车票，就到火车站打个横幅，上书“祝贺你，晓波大叔”或
者“上访无罪，维权有理”什么的，一般48小时之内都会被免费送回原籍。不过，横幅
上要是写“保卫钓鱼岛，抵制日货”可能不管用～
29.有一伙来自乡下的土匪，乘灾年起事，借帝国主义侵略战争成气候，把道听途
说的西方理论凑成蛊惑人心的教派作为指导思想，建政后吃喝嫖赌内部斗争，领XIU弄
死接班人，副统帅叛逃身死，折腾死几千万人仍声称自己代表人民，这就是——太平天
国~
30.小学语文填空：他（）牺牲生命，（）出卖D组织。只求通顺，不求实际意义
，大家可以集思广议，天涯人回复：
他（宁愿）牺牲生命，（也要）出卖D组织。
他（不惜）牺牲生命，（只为）出卖D组织。
他（与其）牺牲生命，（不如）出卖D组织。
他（之所以）牺牲生命，（是因为）出卖D组织。
他（就算）牺牲生命，（也要）出卖D组织。
他（一边）牺牲生命，（一边）出卖D组织。
他（不用）牺牲生命，（就能）出卖D组织。
他（只顾）牺牲生命，（忘了）出卖D组织。
他（被）牺牲生命，（以防止）出卖D组织。
他（大舅）牺牲生命，（二舅）出卖D组织。
他（大舅抛妻弃子投身革命只身潜入敌后最终壮烈）牺牲生命，（二舅利益面前卖
辱求荣摇身一变成汉奸头子最终）出卖D组织。
他（为了他）牺牲生命，（甚至为了他）出卖D组织。
31.找男朋友要避开三类人：读环球时报的，看春节联欢晚会的，上网上百度的。
32.昨晚做了个梦，梦见自己被发诺贝尔奖了，哎哟我草，直接被吓醒了！
33.感冒了，怕去医院太破费，于是对老婆说：“熬点姜汤喝吧。”老婆说：“姜
太贵，咱们还是去医院吧……”
34.问英语老师“山寨”怎么说，老师一下愣住了，过了会儿，一字一顿地说道：
made in China...
35.一女同事忧心重重地从我身边走过，嘴里叨叨着：“糟糕，我可能要红了……
我U盘丢了……”
36.公平的两个社会：原始社会，共产社会。唉，哪个赶不上了～
37.奶奶说如果菜价再这样继续涨下去，那么房子就要跟白菜一个价喽～
38.家住山西，记得从小到大鼻孔一直是黑色的，直到后来在南方上大学，才发现
大家的鼻涕居然是白色滴……
39.半夜十二点，接工信部急电：你网站有涉嫌台独的关键词，请立即删除！否则
根据……吓得我立即从被窝里爬出来，冒着零下30度的严寒上网，五点一刻，终于找那
个违法关键词：转让一台独立服务器。
40.幸福的事：1、不用拼爹竟找到好工作；2、不用献身竟遇到好导演；3、不用买
房竟娶到好媳妇；4、不用送礼竟遇到好大夫；5、不用鉴定竟有了亲儿子；6、不用行
贿竟得到好生意；7、不用装逼竟交到真朋友；8、不用认爹竟遇到好领导。
不幸的事：闹表响了

l*e2013-05-02 07:05

3 楼

1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
3. 纯化genome DNA
4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

n*l2013-05-02 07:05

4 楼

一般来说，博后是养子／养女，博士是亲生的。有些人能做到一视同仁，有些不能，
特别是子女太多的话。连NSF bio sketch 里都需要列出所有学生，但是博士后就
只需要列五年之内的。

【在 m****m 的大作中提到】

: 请教各位faculty，你们心目中自己的PhD学生和薄厚地位如何？
: 见到很多老板和自己的薄厚关系很好，通力合作搞研究。有很多faculty在薄厚期间做
: 出很多好工作。可是也见到这种老板：
: 拼死拼活尽心尽力带PhD学生，觉得那是自己人，希望他们做得好出好文章同时也为自
: 己争光。但对薄厚就是希望你利用自己原有的背景做东西，能少教尽量少教你，最好啥
: 也不教你你能自己出文章。可是有时候不教薄厚出文章也会很慢，老板不觉得自己雇薄
: 厚的钱白花了么？如果好好带薄厚效率本来可以更高的。还有的老板喜欢和自己的学生
: 在背后说薄厚坏话，某些事情喜欢只和学生交流，将薄厚排除在外，只是什么心理？怕
: 薄厚以后独立了和自己抢饭碗么？那为啥招花钱招薄厚，只招学生不就好了？

c*e2013-05-02 07:05

5 楼

赞反腐手段

【在 x**********s 的大作中提到】

: 1.秦朝是我国第一个SheHuiZhuYi国家。
: 2.对中国男人来说，没有房子，掏出的JJ都是软的。
: 3.发改委成立至今只做过两件事：1.涨价，2.替涨价辩护！
: 4.改革开放三十年，中国崛起的只有女人的屁股！
: 6.世界上最遥远的距离，不是天涯海角，也不是生死别离，而是我身在祖国，却不
: 知道祖国发生了什么事。
: 7.做互联网的人一定会遇到三个无法回避的问题：生、死、腾讯。
: 8.目前中国有效的反腐手段有：1.夫妻反目；2.家中被盗；3.意外事故；4.情人举
: 报；5.网民诅咒！
: 9.生完孩子没给红包，猜一名人——缝小刚。

d*p2013-05-02 07:05

6 楼

1500kb? or 1500bp
no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

j*u2013-05-02 07:05

7 楼

这种事情大多因人而异。
如果已经是薄厚了还觉得老板教很重要那还是改行吧。
你要的就是老板的平台，经费，方向和人脉
没别的

c*e2013-05-02 07:05

8 楼

hehe
11.日本明治公司郑重警告：截至今年8月份，中国淘宝网的明治奶粉销量已突破公
司1-8月的全球产量！

【在 x**********s 的大作中提到】

: 1.秦朝是我国第一个SheHuiZhuYi国家。
: 2.对中国男人来说，没有房子，掏出的JJ都是软的。
: 3.发改委成立至今只做过两件事：1.涨价，2.替涨价辩护！
: 4.改革开放三十年，中国崛起的只有女人的屁股！
: 6.世界上最遥远的距离，不是天涯海角，也不是生死别离，而是我身在祖国，却不
: 知道祖国发生了什么事。
: 7.做互联网的人一定会遇到三个无法回避的问题：生、死、腾讯。
: 8.目前中国有效的反腐手段有：1.夫妻反目；2.家中被盗；3.意外事故；4.情人举
: 报；5.网民诅咒！
: 9.生完孩子没给红包，猜一名人——缝小刚。

l*e2013-05-02 07:05

9 楼

我说错了，是1500 bp
我是想买个kit纯化genome DNA, 实验室里的kit都是纯化质粒的
然后PCR这个1500bp的东东

【在 d**p 的大作中提到】

: 1500kb? or 1500bp
: no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.

c*i2013-05-02 07:05

10 楼

说养子太过了，对大多数领域，都只是长工。博士则是传学术香火的
问这种问题本身就莫名其妙。博士后也不会把博士后老板看得跟博士老板一样重要。

【在 n*******l 的大作中提到】

: 一般来说，博后是养子／养女，博士是亲生的。有些人能做到一视同仁，有些不能，
: 特别是子女太多的话。连NSF bio sketch 里都需要列出所有学生，但是博士后就
: 只需要列五年之内的。

x*s2013-05-02 07:05

11 楼

其实淘宝卖的大部分也都是假货....

【在 c********e 的大作中提到】

: hehe
: 11.日本明治公司郑重警告：截至今年8月份，中国淘宝网的明治奶粉销量已突破公
: 司1-8月的全球产量！

d*p2013-05-02 07:05

12 楼

Basically, this is the way to do it.
But you may meet a lot of detailed questions when you work on it.

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

x*t2013-05-02 07:05

13 楼

不觉得啊，所接触的实验室基本出东西都是靠薄厚的

【在 m****m 的大作中提到】

: 请教各位faculty，你们心目中自己的PhD学生和薄厚地位如何？
: 见到很多老板和自己的薄厚关系很好，通力合作搞研究。有很多faculty在薄厚期间做
: 出很多好工作。可是也见到这种老板：
: 拼死拼活尽心尽力带PhD学生，觉得那是自己人，希望他们做得好出好文章同时也为自
: 己争光。但对薄厚就是希望你利用自己原有的背景做东西，能少教尽量少教你，最好啥
: 也不教你你能自己出文章。可是有时候不教薄厚出文章也会很慢，老板不觉得自己雇薄
: 厚的钱白花了么？如果好好带薄厚效率本来可以更高的。还有的老板喜欢和自己的学生
: 在背后说薄厚坏话，某些事情喜欢只和学生交流，将薄厚排除在外，只是什么心理？怕
: 薄厚以后独立了和自己抢饭碗么？那为啥招花钱招薄厚，只招学生不就好了？

c*e2013-05-02 07:05

14 楼

也不是吧？我知道不少人从美国买了，运回去卖的阿

【在 x**********s 的大作中提到】

: 其实淘宝卖的大部分也都是假货....

d*i2013-05-02 07:05

15 楼

最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

r*e2013-05-02 07:05

16 楼

一流大学的高年级博士生很萌的
毕竟毕业就直接自己当老板了

【在 x*******t 的大作中提到】

: 不觉得啊，所接触的实验室基本出东西都是靠薄厚的

l*e2013-05-02 07:05

17 楼

最惨的是，又被recall运回来了。
白白便宜了usps和中国邮政

【在 c********e 的大作中提到】

: 也不是吧？我知道不少人从美国买了，运回去卖的阿

l*e2013-05-02 07:05

18 楼

BAC是什么，为什么genomic DNA那成功呢？
我们做小鼠genotyping不都是用genomic DNA吗。

【在 d****i 的大作中提到】

: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

f*d2013-05-02 07:05

19 楼

这个心态可不好。如果你是PI，精力有限，学生很多，你也不得不这么做吧。
人还是要立足自己的努力，而不能他人的指导、帮忙作为人成功的关键。
大多数时候，别人看到你有这个实力，自然聚拢到你周围了。

【在 m****m 的大作中提到】

: 请教各位faculty，你们心目中自己的PhD学生和薄厚地位如何？
: 见到很多老板和自己的薄厚关系很好，通力合作搞研究。有很多faculty在薄厚期间做
: 出很多好工作。可是也见到这种老板：
: 拼死拼活尽心尽力带PhD学生，觉得那是自己人，希望他们做得好出好文章同时也为自
: 己争光。但对薄厚就是希望你利用自己原有的背景做东西，能少教尽量少教你，最好啥
: 也不教你你能自己出文章。可是有时候不教薄厚出文章也会很慢，老板不觉得自己雇薄
: 厚的钱白花了么？如果好好带薄厚效率本来可以更高的。还有的老板喜欢和自己的学生
: 在背后说薄厚坏话，某些事情喜欢只和学生交流，将薄厚排除在外，只是什么心理？怕
: 薄厚以后独立了和自己抢饭碗么？那为啥招花钱招薄厚，只招学生不就好了？

x*s2013-05-02 07:05

20 楼

鱼龙混杂吧.你说的这种卖家算有良心的。中国人的智慧是无穷大的

【在 c********e 的大作中提到】

: 也不是吧？我知道不少人从美国买了，运回去卖的阿

r*e2013-05-02 07:05

21 楼

1.5kb问题不是很大。

【在 d****i 的大作中提到】

: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

r*e2013-05-02 07:05

22 楼

postdog有些是打工心态
自己把自己定位到实验员，等着老板安排工作
老板呢，忙的要死，最希望你啥都不要烦他，自己想课题自己设计实验，投CNS之前找
个看看署个名就成
。。。。。
两边的期望gap有点大

【在 f******d 的大作中提到】

: 这个心态可不好。如果你是PI，精力有限，学生很多，你也不得不这么做吧。
: 人还是要立足自己的努力，而不能他人的指导、帮忙作为人成功的关键。
: 大多数时候，别人看到你有这个实力，自然聚拢到你周围了。

T*U2013-05-02 07:05

23 楼

16不错
为啥5没了，太那个了？

l*a2013-05-02 07:05

24 楼

说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

m*m2013-05-02 07:05

25 楼

如果是从其他方向switch过来，对目前方向和技术不熟悉。老板又不愿意指导，这是什
么心态？

【在 f******d 的大作中提到】

: 这个心态可不好。如果你是PI，精力有限，学生很多，你也不得不这么做吧。
: 人还是要立足自己的努力，而不能他人的指导、帮忙作为人成功的关键。
: 大多数时候，别人看到你有这个实力，自然聚拢到你周围了。

c*r2013-05-02 07:05

26 楼

re

【在 l******a 的大作中提到】

: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

a*e2013-05-02 07:05

27 楼

说实话，都博士后了，还指望老板指导，确实不够有实力。通常博士后是老板顾来帮带
博士生和发文章的。如果自己连实验和发文都还需老板点播，确实有点难。

【在 m****m 的大作中提到】

: 如果是从其他方向switch过来，对目前方向和技术不熟悉。老板又不愿意指导，这是什
: 么心态？

l*a2013-05-02 07:05

28 楼

真心不明白楼上各位，什么纯化，什么BAC做模板，什么more detail的，在说些什么。
。。

【在 c**********r 的大作中提到】

: re

x*t2013-05-02 07:05

29 楼

大牛lab的薄厚是这样的case比较多，老板一般很久才找你聊一次看看进展，这样的薄
厚确实水平都比较高，自己带着fellowship过来，帮老板发完paper，找到工作走人。
老板的钱一般还花不完，pay学生也没多少。。。
但是一般的lab或者小牛，其实还是主要看老板，都是老板想idea，和薄厚一起制定实
验策略，至少一天问一次实验进展，一起分析，写paper一般也主要靠老板。薄厚不要
老板指导的强人很少的。。

【在 a****e 的大作中提到】

: 说实话，都博士后了，还指望老板指导，确实不够有实力。通常博士后是老板顾来帮带
: 博士生和发文章的。如果自己连实验和发文都还需老板点播，确实有点难。

l*e2013-05-02 07:05

30 楼

你的回答给我很大信心。

【在 l******a 的大作中提到】

: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

a*e2013-05-02 07:05

31 楼

哈哈哈，HYPS之类的博后绝大多数自带干粮去的，然后帮老板带博士生和发文章。当然
，即使自带干粮的博士后，也挤破了头想进去。嘿嘿

【在 x*******t 的大作中提到】

: 大牛lab的薄厚是这样的case比较多，老板一般很久才找你聊一次看看进展，这样的薄
: 厚确实水平都比较高，自己带着fellowship过来，帮老板发完paper，找到工作走人。
: 老板的钱一般还花不完，pay学生也没多少。。。
: 但是一般的lab或者小牛，其实还是主要看老板，都是老板想idea，和薄厚一起制定实
: 验策略，至少一天问一次实验进展，一起分析，写paper一般也主要靠老板。薄厚不要
: 老板指导的强人很少的。。

w*d2013-05-02 07:05

32 楼

貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。

l*a2013-05-02 07:05

33 楼

我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？

【在 w*******d 的大作中提到】

: 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。

r*e2013-05-02 07:05

34 楼

你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
。这是当年经典的做法。

【在 l******a 的大作中提到】

: 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？

s*r2013-05-02 07:05

35 楼

运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多

【在 r***e 的大作中提到】

: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。

l*i2013-05-02 07:05

36 楼

不明白为什么不用合成基因，几百块两个星期就行了，买什么各种试剂盒也不少钱啊？
是为了练习积攒经验么？

z*62013-05-02 07:05

37 楼

好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
...

m*z2013-05-02 07:05

38 楼

基本是这样。
难度相当于十年前本科毕设课题。

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

a*a2013-05-02 07:05

39 楼

做reporter construct的话，一般包括第一个exon效果最好把

【在 r***e 的大作中提到】

: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。

h*22013-05-02 07:05

40 楼

+1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定

【在 a*******a 的大作中提到】

: 做reporter construct的话，一般包括第一个exon效果最好把

t*w2013-05-02 07:05

41 楼

我可以分析ChIPseq data，但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
了。

【在 h**2 的大作中提到】

: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定

d*i2013-05-02 07:05

42 楼

求JBC papers link。。谢谢！

【在 z*******6 的大作中提到】

: 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
: 你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
: 不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
: ...

h*22013-05-02 07:05

43 楼

哈哈，我收$0，还请他吃顿饭交个朋友，抢你生意了

【在 t*****w 的大作中提到】

: 我可以分析ChIPseq data，但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
: 了。

l*e2013-05-02 07:05

44 楼

1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
3. 纯化genome DNA
4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

d*p2013-05-02 07:05

45 楼

1500kb? or 1500bp
no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

l*e2013-05-02 07:05

46 楼

我说错了，是1500 bp
我是想买个kit纯化genome DNA, 实验室里的kit都是纯化质粒的
然后PCR这个1500bp的东东

【在 d**p 的大作中提到】

: 1500kb? or 1500bp
: no PCR kit can amplify 1500kb fragment yet.

d*p2013-05-02 07:05

47 楼

Basically, this is the way to do it.
But you may meet a lot of detailed questions when you work on it.

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

d*i2013-05-02 07:05

48 楼

最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

l*e2013-05-02 07:05

49 楼

BAC是什么，为什么genomic DNA那成功呢？
我们做小鼠genotyping不都是用genomic DNA吗。

【在 d****i 的大作中提到】

: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

r*e2013-05-02 07:05

50 楼

1.5kb问题不是很大。

【在 d****i 的大作中提到】

: 最好买BAC做模板，genomic DNA很难成功。

l*a2013-05-02 07:05

51 楼

说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

c*r2013-05-02 07:05

52 楼

re

【在 l******a 的大作中提到】

: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

l*a2013-05-02 07:05

53 楼

真心不明白楼上各位，什么纯化，什么BAC做模板，什么more detail的，在说些什么。
。。

【在 c**********r 的大作中提到】

: re

l*e2013-05-02 07:05

54 楼

你的回答给我很大信心。

【在 l******a 的大作中提到】

: 说实话，我觉得，设计2个引物，拿点细胞裂解了直接pcr，不觉得有什么tricky的。

w*d2013-05-02 07:05

55 楼

貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。

l*a2013-05-02 07:05

56 楼

我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？

【在 w*******d 的大作中提到】

: 貌似先做5'-RACE比较好，然后克隆到ATG之前。

r*e2013-05-02 07:05

57 楼

你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
。这是当年经典的做法。

【在 l******a 的大作中提到】

: 我真服了，都是高人啊，我想知道promoter 会transcribe吗？

s*r2013-05-02 07:05

58 楼

运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多

【在 r***e 的大作中提到】

: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。

l*i2013-05-02 07:05

59 楼

不明白为什么不用合成基因，几百块两个星期就行了，买什么各种试剂盒也不少钱啊？
是为了练习积攒经验么？

z*62013-05-02 07:05

60 楼

好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
...

m*z2013-05-02 07:05

61 楼

基本是这样。
难度相当于十年前本科毕设课题。

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

a*a2013-05-02 07:05

62 楼

做reporter construct的话，一般包括第一个exon效果最好把

【在 r***e 的大作中提到】

: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。

h*22013-05-02 07:05

63 楼

+1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定

【在 a*******a 的大作中提到】

: 做reporter construct的话，一般包括第一个exon效果最好把

t*w2013-05-02 07:05

64 楼

我可以分析ChIPseq data，但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
了。

【在 h**2 的大作中提到】

: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定

d*i2013-05-02 07:05

65 楼

求JBC papers link。。谢谢！

【在 z*******6 的大作中提到】

: 好像我们实验室的课题啊... 不过我们当时是老paper了，如果你需要的话我可以发给
: 你，连续几篇JBC说克隆promoter的事... 然后寻找调控原件...
: 不过我是不用担心了，老鼠都做好等我做了... 不过我就是要学习一下这个课题的历史
: ...

h*22013-05-02 07:05

66 楼

哈哈，我收$0，还请他吃顿饭交个朋友，抢你生意了

【在 t*****w 的大作中提到】

: 我可以分析ChIPseq data，但是我要的报酬是5千美金。所以显然克隆promoter便宜多
: 了。

l*e2013-05-02 07:05

67 楼

1.5kb，怎么pcr，怎么成，没啥担心的。即使GC高，换个LA taq也就成了。

h*12013-05-02 07:05

68 楼

data base能查到的东西你让LZ瞎折腾个什么？

【在 r***e 的大作中提到】

: 你理解错了，他说的race是确定转录起始点。然后克隆起始点前的序列到报告基因前面
: 。这是当年经典的做法。

h*12013-05-02 07:05

69 楼

没必要那么多，十几个到几十个bp足矣。

【在 h**2 的大作中提到】

: +1
: 不一定得包全，几百bp of exon 1即可
: 不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定

x*e2013-05-02 07:05

70 楼

1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
有TSS，引物设计在TSS之前。
4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用
于in vitro assay。GFP， lacZ，luciferase等reporter vector中选个适合自己的。
确定你要用的酶切位点。克隆genomic DNA有时候酶切位点有限制，设计引物的时候要
参考reporter vector的MCS和目标序列。
暂时就想到这些。

【在 l*******e 的大作中提到】

: 1. 我现在要克隆一个基因X的promoter序列，软件分析了一下，大约1500kb的样子
: 2. 买个kit, genome DNA isolation（谁给推荐一个？）
: 3. 纯化genome DNA
: 4. 设计引物PCR这个大约1500bp的片段，在TSS前面
: 5. 然后ligate到一个luciferase的reporter vector里
: 没做过这玩意，大家帮忙看看哪里不对

x*e2013-05-02 07:05

71 楼

哈哈深有体会

【在 s******r 的大作中提到】

: 运气不好的话折腾RACE的力气比楼主那5步加一块都多

x*e2013-05-02 07:05

72 楼

再补充一个。克隆genomic sequence时如果找不到合适的酶切位点（克隆序列越长，酶
切位点越受限）可以考虑gibson assembly。

Seq
exon

【在 x********e 的大作中提到】

: 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
: 等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
: 2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
: 土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
: template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
: library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
: 后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
: 3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
: 有TSS，引物设计在TSS之前。
: 4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用

s*y2013-05-02 07:05

73 楼

我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。

Seq
exon

【在 x********e 的大作中提到】

: 1.你克隆promoter的目的是啥？如果是看有没有转录因子调控的话，需要看看ChIP-Seq
: 等数据，确定enhancer包含在里面了。单纯minimal promoter只要几百bp就够了。
: 2.克隆模版有两种。一个是自己提纯genomic DNA。1500bp基本上不需要kit，裂解然后
: 土法提纯一下就p得出。运气好的话直接拿裂解液p都能成功。更好的方式是用BAC做
: template。B以前基因组测序的时候别人就把genomic DNA切成小片段放到载体里做成了
: library。去blast一下就能得到包含你目标序列的BAC clone。买回来摇菌提质粒，然
: 后用质粒做模版p，效果比用genomic DNA高很多。
: 3. 设计引物。一般是取upstream promoter sequence到第一个exon。如果第一个exon
: 有TSS，引物设计在TSS之前。
: 4. vector。不知道你做reporter construct的目的是什么，不过luciferase好像多用

y*u2013-05-02 07:05

74 楼

promoter reporter这种实验还有人在做啊，灌水么？什么年代了。
要看regulatory elements 就看至少一个sub TAD的
promoter clone这种东西嘛反正拿到的结果都是technique artifact，也无所谓怎么做
了，真的。

路子

【在 s******y 的大作中提到】

: 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
: 正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
: 你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
: 虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
:
: Seq
: exon

x*e2013-05-02 07:05

75 楼

不是所有人做的东西都能搞到HiC data。另外，genomic approach没有in vivo证明没
有实际意义。你也不知道别人做promoter reporter的目的是啥啊。

【在 y*********u 的大作中提到】

: promoter reporter这种实验还有人在做啊，灌水么？什么年代了。
: 要看regulatory elements 就看至少一个sub TAD的
: promoter clone这种东西嘛反正拿到的结果都是technique artifact，也无所谓怎么做
: 了，真的。
:
: 路子

x*e2013-05-02 07:05

76 楼

你需要更新一下你的思维。PCR普及之前的确都是用酶切做克隆。

路子

【在 s******y 的大作中提到】

: 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
: 正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
: 你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
: 虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
:
: Seq
: exon