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【关于Gibson Assembly】问问大家?
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【关于Gibson Assembly】问问大家?# Biology - 生物学
w*a
1
大家都在用Gibson Assembly吗?
大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗?怎么发现切胶后,效率很低,转
到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
大家遇到同样的情况吗?有经验的说说。
非常感谢!
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T*t
2
我都没有切胶纯化。
insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版,然后用spin column纯化。
vector是酶切linearize了之后直接用。
我转化的效率不算高,但是一般都能拿到想要的colony。
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w*e
3
我用了,效果很好呀
一般6个里面就有一个是对的
关键是两端互补的序列一定要准确,你可以增加这个序列的长度,来增加效率

【在 w********a 的大作中提到】
: 大家都在用Gibson Assembly吗?
: 大家的vector backbone和insert都是切胶纯化的吗?怎么发现切胶后,效率很低,转
: 到大肠杆菌以后一般很难得到colony。
: 大家遇到同样的情况吗?有经验的说说。
: 非常感谢!

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w*a
4
我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是
简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比
实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的
construct经常是乱七八糟。
你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全
没有问题吗?
另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢

【在 w*e 的大作中提到】
: 我用了,效果很好呀
: 一般6个里面就有一个是对的
: 关键是两端互补的序列一定要准确,你可以增加这个序列的长度,来增加效率

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w*a
5
Vector 酶切linearize了之后, 至少你也做个spin colum纯化吧?还是连这个也省了?
另外,vector如果不是特别长的话,是不是用PCR扩增效果会好些?

【在 T**********t 的大作中提到】
: 我都没有切胶纯化。
: insert我是PCR之后用DpnI处理降解掉模版,然后用spin column纯化。
: vector是酶切linearize了之后直接用。
: 我转化的效率不算高,但是一般都能拿到想要的colony。

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w*e
6
我都是切胶纯化PCR产物的,目前还没问题
PCR酶就是他们推荐的Q5类的。
互补序列可以20bp,我都是按照推荐的量加的

谢谢

【在 w********a 的大作中提到】
: 我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是
: 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比
: 实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的
: construct经常是乱七八糟。
: 你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全
: 没有问题吗?
: 另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢

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s*s
7
用的qiagen的gel extractionkit?
这个kit出来的东西很脏,做比较小心的实验,我一般会
再用MinElute过一遍,会浓缩并且干净很多

谢谢

【在 w********a 的大作中提到】
: 我现在的问题是如果用切胶纯化,转到大肠杆菌以后基本得不到colony; 而如果只是
: 简单的用PCR cleanup的kit纯化的话,因为insert PCR产物经常有杂带 (而且杂带比
: 实际的insert要短很多,所以被连上的效率会比insert高很多),分离出来的
: construct经常是乱七八糟。
: 你如果增加互补序列的长度的话,一般增加到多少bp?这样的话,你用切胶纯化也完全
: 没有问题吗?
: 另外,进行G.A.反应的时候,你们都是按照Neb推荐的量加的backbone和vector吗?谢谢

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T*t
8
酶切后的vector我不纯化,直接用。因为需要的量不多,大概100ng左右的vector,然
后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control,酶切过的vector直接
转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做,基本上没什么大问题。
pick 3个colony的话,至少有两个是对的。
你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么?
Gibson需要的vector用量不多,为什么要用PCR扩增?按我上面的用量计算,做一次
miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多,而且还要
考虑长PCR出错的概率风险吧。

了?

【在 w********a 的大作中提到】
: Vector 酶切linearize了之后, 至少你也做个spin colum纯化吧?还是连这个也省了?
: 另外,vector如果不是特别长的话,是不是用PCR扩增效果会好些?

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w*a
9
如果有好几个insert fragments,你是直接跟vector一起G.A? 还是先把几个
fragments做G.A.,然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert,然后再
跟vector 做G.A.?

【在 T**********t 的大作中提到】
: 酶切后的vector我不纯化,直接用。因为需要的量不多,大概100ng左右的vector,然
: 后同等molar的insert就好了。反正我都会做negative control,酶切过的vector直接
: 转没有colony。然后转出来的colony也都要测过序才会往下做,基本上没什么大问题。
: pick 3个colony的话,至少有两个是对的。
: 你的问题好像在于insert的PCR出错率太高啊。是模板不纯么?
: Gibson需要的vector用量不多,为什么要用PCR扩增?按我上面的用量计算,做一次
: miniprep够我做好几百个gibson assembly了。PCR需要加的试剂比酶切要多,而且还要
: 考虑长PCR出错的概率风险吧。
:
: 了?

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z*n
10
提高浓度,不要按推荐浓度反应,比如10ul反应体系,5ul2x buffer mix ,剩下5ul全
部用vector 和insert 反应两个小时
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w*a
11
是的。一直用Qiagen。
你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后,在用MinElute (PCR
purification or gel extraction kit?)再纯化一遍?这样岂不损失更大?

【在 s******s 的大作中提到】
: 用的qiagen的gel extractionkit?
: 这个kit出来的东西很脏,做比较小心的实验,我一般会
: 再用MinElute过一遍,会浓缩并且干净很多
:
: 谢谢

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w*a
12
那你浓度提高到多少?vector和insert的配比呢?

【在 z*******n 的大作中提到】
: 提高浓度,不要按推荐浓度反应,比如10ul反应体系,5ul2x buffer mix ,剩下5ul全
: 部用vector 和insert 反应两个小时

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s*s
13
80%回收率总有的,不差那么点

【在 w********a 的大作中提到】
: 是的。一直用Qiagen。
: 你是说用Qiagen的gel extraction kit纯化了之后,在用MinElute (PCR
: purification or gel extraction kit?)再纯化一遍?这样岂不损失更大?

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s*s
14
2+1肯定一起做了,3+1的话也没问题,效率低一点。
4+1没做过。

【在 w********a 的大作中提到】
: 如果有好几个insert fragments,你是直接跟vector一起G.A? 还是先把几个
: fragments做G.A.,然后拿这个产物做template得到最终的一个整个的insert,然后再
: 跟vector 做G.A.?

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z*n
15
看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧,vector2ul insertion
3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。

【在 w********a 的大作中提到】
: 那你浓度提高到多少?vector和insert的配比呢?
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w*a
16
你说的是G.A.反应两个小时,然后SOC recovery 的时候再两个小时?

【在 z*******n 的大作中提到】
: 看切胶回收的亮度吧, 一般切胶回收也就50-60 ng/ul浓度吧,vector2ul insertion
: 3ul, 反应完转化Soc recovery时间长点至少2小时。

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