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qPCR 计算问题

qPCR 计算问题# Biology - 生物学

e*p2014-01-21 08:01

1 楼

记得有人问过但找不到帖子了，
三次重复试验，每次QPCR有三个TECH REP
Rep1
GOI-Houskeep
delta Ct: Con -2.9; Treatment: 2.1
Rep2
GOI-Houskeep
delta Ct: Con -1.9; Treatment: 2.0
Rep3
GOI-Houskeep
detla Ct: Con -2.1; Treatment: 3.0
请问如何综合三次结果用DELTA DELTA CT的方法算出 fold change +- 标准误啊，而且
把CON的平均值算成1
请高人指点

T*u2014-01-21 08:01

2 楼

RT-PCR 结果的计算方法
未名三楼楼长 03-25-2011
RT-PCR 技术已经推广了有些年头。但从众多已发表的文章中不难看出，很多试验
者的计算多多少少都存在问题。甚至，有些介绍算法的文章都存在明显的错误。因
此，有必要对试验人员讲解计算方法。这样不仅可以尽可能避免计算错误，也能更
好地理解RT-PCR 原理。以下讲解只针对单色RT-PCR，也就是说，在任意一个
well 里，只能用一对primers 检测一个样品。
一、RT-PCR 到底要测什么？
RT-PCR（这里，RT 指 real-time。区别于rt：逆转录）是量化基因表达的一种方
法。如果说western blot 是针对蛋白水平，RT-PCR 就是针对mRNA 水平。
基因表达在蛋白水平上，已经经过了多个数量级的放大。或者说一个mRNA 模板
分子可以翻译出无数蛋白分子。所以，蛋白可以很容易地用抗体探测到。但
mRNA 数目太少，直接用探针检测有困难。所以必须要人为放大扩增才能检测
到。这就是PCR 的目的。
不管是先做逆转录得cDNA，再做PCR，还是逆转录+PCR 一气呵成，RT-PCR 归
根结底是以mRNA 为模板的。无论怎样复杂的曲线分析、Ct 值的转化和计算，
RT-PCR 最终的目的是要探究样品中mRNA 的含量。所以我们要利用测量值（Ct
值）计算出mRNA 的含量。重复一遍：计算结果要表示出mRNA 的量。
二、Ct 值的概念以及两个Ct 值的平均值
1，RT-PCR 得出的直接测量数据是Ct 值。这个Ct 值跟我们的终极目标mRNA 含
量是什么关系呢？
如上图，这是一个对数扩增曲线的示意图。Ct 值代表曲线达到阈值水平时的cycle
数。例如，上图中左边曲线的Ct 值为a。那么该样品中的mRNA 含量如何表达？
我们定义阈值线所代表的mRNA 含量为1。每经过一个cycle，双链DNA 产品就
翻一番。该样品经过了a 次cycle，PCR 产物是模板数量的2a 倍，达到了阈值水平
1。那么样品中原有mRNA 模板的含量就是a 2
1 。
2，我们现在有两条曲线，得出两个Ct 值a 和b。那么这两个样品的平均Ct 值是多
少呢？我可以很负责任地告诉你，答案
2
a + b
是错误的。
打个简单的比方就明白了。我和你分pizza 饼。我吃了1/2 张，你吃了1/4 张，你
能说我们人均1/3 张饼吗？再比如，一个pH1 的溶液和一个pH3 的溶液（非缓冲
溶液），等容混合以后的平均pH 是2 吗？
在第1 小节中我们已经了解到Ct 值的意义。在表达mRNA 的算式中，Ct 值处于分
母和指数的双重位置上。那么两个样品的平均Ct 值，应该是这两个样品等容积混
合后的“混合样品”的Ct 值。计算公式：
⎟ ⎟ ⎟ ⎟
⎠
⎞
⎜ ⎜ ⎜ ⎜
⎝
⎛ +
−
2
2
1
2
1
log2
a b
三、内参的引用及其简单计算
如同western blot 要用某housekeeping gene 做loading control，RT-PCR 也要采用某
housekeeping gene 作为内参。最后结果表达为目标基因mRNA 含量与housekeeping
gene 的mRNA 含量的比值。
假设上图中，左边曲线使housekeeping gene，右边曲线为目标基因，则结果如下表
示： a b
a
b
−
−
−
= 2
2
2 。注意，a-b 通常是个负数。有的时候为了看起来简单，可以直接表
达为a-b，我们一般用ΔCt 来代表这个数值。
四、duplicates 的处理
为了减小误差，也为了防止某个well 的反应出现意外而丢失这个数据点，我们经
常要做duplicates，甚至triplicates。
一对duplicates 通常给出4 个数字，见下表：
Housekeeping a1 a2
Target b1 b2
我看到很多教程上是这样教的：分别得出ΔCt1=（a1-b1）和ΔCt2=（a2-b2），然后
求ΔCt1 和ΔCt2 的代数平均。这样的算法有两处明显错误：
1，不论Ct 值还是ΔCt 值，都不能简单地搞代数平均。这一点，在第三段第2 节已
经介绍过了。不再赘述。
2，这个算法显然把a1 和b1 划归一组，把a2 和b2 划到了另一组。这样的做法是
不恰当的。实验中没有任何操作表明（1）a1 和b1 是对应的，（2）a1 不能b2 对
应。a2 亦然。实际上，是a1、a2 的平均值对应b1、b2 的平均值。平均值的算法请
参照第二段第2 节，对应内参的计算请参看第三段。综合起来，这个样品的最终数
据，也就是它的目标基因mRNA 与housekeeping gene 的mRNA 的比值是
R = 1 2
1 2
2 2
2 2
b b
a a
− −
− −
+
+
从另外一个角度说，duplicates 这4 个数字来自同一个样品，只能得出唯一的值来
代表这个样品，并参与后面的统计学分析。简单地讲，就是不能因为作了
duplicates，就把样本数n 变成了2n。
四、对照组与治疗组的对比方法和统计学分析
至此，RT-PCR 的计算没有最终完成。还需要最后的正常化（normalization）和统
计学分析。将对照组（0 组），治疗1 组（1 组）、2 组……所有R 值都用对照组
（也可以用别的组）各样品R 值的代数平均来进行正常化。用正常化后的数字
（暂且称它为N 值）做统计学分析。比如0 组平均N 值永远为1。
RT-PCR 是比较敏感的试验方法。一般来说，与0 组差距超过5-10 倍才算有生物学
意义。所以，做统计的时候，有人建议把每个N 值都转换为lgN。由于又取回了对
数，lgN 从某种意义上说，与Ct 值等价。但这并不意味着，就可以不经过以上计
算，直接用Ct 值或者说ΔCt 值来做统计学分析。
五、补充
1，两个正数求平均，无论是代数平均、几何平均、对数平均，平均值总是落在这
两个数值之间。如果这两个数值差别很小，那么所有的平均值几乎相等。但这并不
意味着可以任意用一种平均代替另一种平均算法。
2，在笔算、计算器年代，由于条件限制，可以用简便的平均代替正确的平均算
法。前提是两个数值相近，误差小于一定范围。现在是电脑时代，制作一个模板，
以后多次套用，并不是很艰难的事情。所以，我还是建议大家根据公式，仔细做一
个模板。一来，并不是每个样品都符合“理想条件”；二来，也对试验原理有一个
基本了解，有助于更好理解试验数据，并进行trouble shooting。

【在 e****p 的大作中提到】

: 记得有人问过但找不到帖子了，
: 三次重复试验，每次QPCR有三个TECH REP
: Rep1
: GOI-Houskeep
: delta Ct: Con -2.9; Treatment: 2.1
: Rep2
: GOI-Houskeep
: delta Ct: Con -1.9; Treatment: 2.0
: Rep3
: GOI-Houskeep

T*u2014-01-21 08:01

3 楼

https://www.dropbox.com/s/zb1w7eyj1186u0z/032511RT-PCR%E8%AE%A1%E7%AE%97.pdf
pdf link

【在 e****p 的大作中提到】

e*p2014-01-21 08:01

4 楼

多谢文件，但并没有提到如何算标准误的问题，DELTA CT不能平均我知道，但R值计算
每个重复试验（对照组和试验组）只能计算一个R值
我一般用2^delta delta ct 算出变化倍数再平均，但每次对照组的值都是1了，没法算
标准误。用没有关于计算标准误的资料。

pdf

【在 T****u 的大作中提到】

: https://www.dropbox.com/s/zb1w7eyj1186u0z/032511RT-PCR%E8%AE%A1%E7%AE%97.pdf
: pdf link

T*u2014-01-21 08:01

5 楼

https://www.dropbox.com/s/uw7td57yrb353pc/Qpcr.pdf

【在 e****p 的大作中提到】

: 多谢文件，但并没有提到如何算标准误的问题，DELTA CT不能平均我知道，但R值计算
: 每个重复试验（对照组和试验组）只能计算一个R值
: 我一般用2^delta delta ct 算出变化倍数再平均，但每次对照组的值都是1了，没法算
: 标准误。用没有关于计算标准误的资料。
:
: pdf

e*p2014-01-21 08:01

6 楼

哇这个很有用，多谢多谢TIENIU

【在 T****u 的大作中提到】

: https://www.dropbox.com/s/uw7td57yrb353pc/Qpcr.pdf

l*s2014-01-21 08:01

7 楼

Ct不能平均? 这个未必吧。这里的误差算的是PCR测量误差，一般来说是线性的，所以
算平均应该没什么问题。比如一个值16.5，一个值17.0，应该可以平均起来为16.75.

【在 e****p 的大作中提到】

d*i2014-01-21 08:01

8 楼

我觉得应该是算出deltaCt以后再平均。

【在 l***s 的大作中提到】

: Ct不能平均? 这个未必吧。这里的误差算的是PCR测量误差，一般来说是线性的，所以
: 算平均应该没什么问题。比如一个值16.5，一个值17.0，应该可以平均起来为16.75.

l*s2014-01-21 08:01

9 楼

DeltaCt以后就晚了。因为是测量误差，应该首先address。我们的做法是：对于每个
基因，取duplicated Ct平均值，然后算deltaCt。因此最终只有一个deltaCt值。

【在 d****i 的大作中提到】

:
: 我觉得应该是算出deltaCt以后再平均。

d*i2014-01-21 08:01

10 楼

加入三个replicates，那你怎么计算SE？

【在 l***s 的大作中提到】

: DeltaCt以后就晚了。因为是测量误差，应该首先address。我们的做法是：对于每个
: 基因，取duplicated Ct平均值，然后算deltaCt。因此最终只有一个deltaCt值。

l*s2014-01-21 08:01

11 楼

Technical replicates算SE没有什么意义。一般来说同一实验组内Ct variation不超
过0.2，SE几乎为0. 正确的做法是做三次独立的实验，这才是真正意义上的replicates。

【在 d****i 的大作中提到】

:
: 加入三个replicates，那你怎么计算SE？

T*u2014-01-21 08:01

12 楼

其实大家不要太纠结数学上的这些算法
如果你的实验结果因为怎么算SE会有不同的结论，这个变化也实在是太trivial了。