问个lentiviral vector cloning问题# Biology - 生物学
h*8
1 楼
Looks like h4 is not on e-file list, so I539 can not be e-filed if I change
from F1 to h4, right?
Thanks
from F1 to h4, right?
Thanks
b*2
2 楼
而且是男人，已经好几次了，跑进来叫个不停
x*o
3 楼
想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
m*o
4 楼
同问....
b*a
5 楼
他是怕你淹着，人家心说：这傻冒，怎么往水里冲呢。
【在 b*****2 的大作中提到】
: 而且是男人，已经好几次了，跑进来叫个不停
【在 b*****2 的大作中提到】
: 而且是男人，已经好几次了，跑进来叫个不停
j*i
6 楼
你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。
试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。
c*e
7 楼
你不觉得他们都是用那种怜悯的眼神看你在水里的么？
【在 b*****2 的大作中提到】
: 而且是男人，已经好几次了，跑进来叫个不停
【在 b*****2 的大作中提到】
: 而且是男人，已经好几次了，跑进来叫个不停
x*o
8 楼
是T4，16度和室温都试过了，没太大区别。关键是这个2kb的带，解决不了。
【在 j******i 的大作中提到】
: 你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
: 试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。
【在 j******i 的大作中提到】
: 你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
: 试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。
l*i
9 楼
严重同意
【在 b******a 的大作中提到】
: 他是怕你淹着，人家心说：这傻冒，怎么往水里冲呢。
【在 b******a 的大作中提到】
: 他是怕你淹着，人家心说：这傻冒，怎么往水里冲呢。
a*a
10 楼
换感受态
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
y*u
11 楼
我洗澡的时候小黄总是要蹲守，时刻提醒我＂精神病患者＂里的经典镜头
j*i
12 楼
6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
ligase, Gibbson Assembly.
【在 x******o 的大作中提到】
: 是T4，16度和室温都试过了，没太大区别。关键是这个2kb的带，解决不了。
ligase, Gibbson Assembly.
【在 x******o 的大作中提到】
: 是T4，16度和室温都试过了，没太大区别。关键是这个2kb的带，解决不了。
m*h
13 楼
无论我在哪里，周围都是围了一圈
【在 y*********u 的大作中提到】
: 我洗澡的时候小黄总是要蹲守，时刻提醒我＂精神病患者＂里的经典镜头
【在 y*********u 的大作中提到】
: 我洗澡的时候小黄总是要蹲守，时刻提醒我＂精神病患者＂里的经典镜头
x*o
14 楼
换什么感受态？
【在 a*******a 的大作中提到】
: 换感受态
【在 a*******a 的大作中提到】
: 换感受态
y*u
15 楼
你不羞呀?
【在 m***h 的大作中提到】
: 无论我在哪里，周围都是围了一圈
【在 m***h 的大作中提到】
: 无论我在哪里，周围都是围了一圈
s*s
16 楼
要么试试不要磷酸化，直接多加5倍insertion连，然后用96孔板pcr检测insertion
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
m*h
17 楼
习惯了
【在 y*********u 的大作中提到】
: 你不羞呀?
【在 y*********u 的大作中提到】
: 你不羞呀?
a*a
18 楼
你做其他lenti克隆有问题么？
你的对照板是重组么？
我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
觉得特别不好连
【在 x******o 的大作中提到】
: 换什么感受态？
你的对照板是重组么？
我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
觉得特别不好连
【在 x******o 的大作中提到】
: 换什么感受态？
w*6
19 楼
我家老大就喜欢人拉屎的时候进厕所。不让进，就在外面叫，挠门。你说说，他不嫌臭
吗
吗
l*a
20 楼
试试别的e coli strain， stbl3是endA+，不好handle，有可能你的dna被降解了
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
x*o
21 楼
做短片段（1-2kb）的没太大问题，2kb的情况出现几率比较小，偶尔会有，没太留意。
对照板是指vector only吗？只有几个斑，没有挑过。
我以前dh5a和stbl3都用过，做短的没问题，最近做长insert总是做不出来。也许试试
换个batch感受态?
【在 a*******a 的大作中提到】
: 你做其他lenti克隆有问题么？
: 你的对照板是重组么？
: 我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
: 觉得特别不好连
对照板是指vector only吗？只有几个斑，没有挑过。
我以前dh5a和stbl3都用过，做短的没问题，最近做长insert总是做不出来。也许试试
换个batch感受态?
【在 a*******a 的大作中提到】
: 你做其他lenti克隆有问题么？
: 你的对照板是重组么？
: 我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
: 觉得特别不好连
x*o
22 楼
给推荐一个 ？
【在 l******a 的大作中提到】
: 试试别的e coli strain， stbl3是endA+，不好handle，有可能你的dna被降解了
【在 l******a 的大作中提到】
: 试试别的e coli strain， stbl3是endA+，不好handle，有可能你的dna被降解了
x*o
23 楼
gibbson不考虑了，insert太长，不想再pcr测序
我试试T7吧。相对于T4，T7是对stick end的完整程度要求不高，我理解的对吧？
不过我总觉得连接不是最主要的问题，再怎么连接不好也不会出现大量的2kb现象吧。
【在 j******i 的大作中提到】
: 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
: ligase, Gibbson Assembly.
我试试T7吧。相对于T4，T7是对stick end的完整程度要求不高，我理解的对吧？
不过我总觉得连接不是最主要的问题，再怎么连接不好也不会出现大量的2kb现象吧。
【在 j******i 的大作中提到】
: 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
: ligase, Gibbson Assembly.
c*u
24 楼
NEB turbo
【在 x******o 的大作中提到】
: 给推荐一个 ？
【在 x******o 的大作中提到】
: 给推荐一个 ？
M*g
25 楼
stbl3 is really bad comp cell.
try neb stable comp cells.
gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
fidelity.
try neb stable comp cells.
gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
fidelity.
q*g
26 楼
stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。
x*o
27 楼
可是PCR之后不是还要测序6kb吗？
【在 M******g 的大作中提到】
: stbl3 is really bad comp cell.
: try neb stable comp cells.
: gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
: fidelity.
【在 M******g 的大作中提到】
: stbl3 is really bad comp cell.
: try neb stable comp cells.
: gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
: fidelity.
x*o
28 楼
试过DH5a也做不出来，而且DH5a难道不是不适合做unstable clone吗？
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？
【在 q******g 的大作中提到】
: stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？
【在 q******g 的大作中提到】
: stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。
M*g
29 楼
sequencing is so cheap and easy nowadays.
I have cloned a 6.3 kb gene using Q5 pcr and seen no mutations. I love Q5
and gibson assembly. highly recommend them to you.
【在 x******o 的大作中提到】
: 可是PCR之后不是还要测序6kb吗？
I have cloned a 6.3 kb gene using Q5 pcr and seen no mutations. I love Q5
and gibson assembly. highly recommend them to you.
【在 x******o 的大作中提到】
: 可是PCR之后不是还要测序6kb吗？
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