请教关于Hsp90的或者general 的 immunoprecipiation的实验# Biology - 生物学
a*g
1 楼
有什么办法用Scoups？
我已经不在学校里了。
好像个人花钱也不行。
大家都是怎么能到Scoups？
谢谢。
我已经不在学校里了。
好像个人花钱也不行。
大家都是怎么能到Scoups？
谢谢。
yo
2 楼
有点好奇，看到有些城市的blockshopper信息很全，不但有整条街每个住户的姓名，还
经常会贴出房屋买主和卖主的工作单位和教育背景，比如这样的（随便找了一个举例说
明），那是不是说如果在这地区买/卖房一定会被列上去呢？个人倒也不是很在意，只
是觉得互联网时代真是无可抵挡，上个学，买个房，再跑个马拉松，就什么隐私都没了
。。。
http://longisland.blockshopper.com/news/story/2000114509-Admini
经常会贴出房屋买主和卖主的工作单位和教育背景，比如这样的（随便找了一个举例说
明），那是不是说如果在这地区买/卖房一定会被列上去呢？个人倒也不是很在意，只
是觉得互联网时代真是无可抵挡，上个学，买个房，再跑个马拉松，就什么隐私都没了
。。。
http://longisland.blockshopper.com/news/story/2000114509-Admini
x*a
3 楼
一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4 和10mM
MgCl2.
结果是Hsp90的条带勉强可以看到，别的binding的protein 条带要不很smear要不根本
看不到。
换跟Hsp90作用的蛋白做IP也是看不到Hsp90的条带。
希望大家帮我出出主意，实在做ip很菜鸟。
谢谢啦
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4 和10mM
MgCl2.
结果是Hsp90的条带勉强可以看到，别的binding的protein 条带要不很smear要不根本
看不到。
换跟Hsp90作用的蛋白做IP也是看不到Hsp90的条带。
希望大家帮我出出主意，实在做ip很菜鸟。
谢谢啦
n*w
4 楼
dynabeads你是按照protocol来做的吗？dynabeads work great for me.
x*a
5 楼
恩，protocol的incubation time都很短，我都延长了时间，除了washing buffer我用
的kinase buffer，其它都follow protocol来的。
现在考虑overexpress flag的蛋白，再用flag pull down或者western，不知道能不能
做出来。
谢谢回复~
的kinase buffer，其它都follow protocol来的。
现在考虑overexpress flag的蛋白，再用flag pull down或者western，不知道能不能
做出来。
谢谢回复~
n*w
6 楼
But the protocol is first to bind antibody to the beads and then bind your
antigen. What you described here is you mixed antigen and antibody first and
then added beads.
【在 x*********a 的大作中提到】
: 恩，protocol的incubation time都很短，我都延长了时间，除了washing buffer我用
: 的kinase buffer，其它都follow protocol来的。
: 现在考虑overexpress flag的蛋白，再用flag pull down或者western，不知道能不能
: 做出来。
: 谢谢回复~
antigen. What you described here is you mixed antigen and antibody first and
then added beads.
【在 x*********a 的大作中提到】
: 恩，protocol的incubation time都很短，我都延长了时间，除了washing buffer我用
: 的kinase buffer，其它都follow protocol来的。
: 现在考虑overexpress flag的蛋白，再用flag pull down或者western，不知道能不能
: 做出来。
: 谢谢回复~
x*a
7 楼
I tried both ways, did not see a difference.
What is the antibody and lysate ratio you usually use?
What is the antibody and lysate ratio you usually use?
n*w
8 楼
okay. so in this case, maybe your HSP90 antibody or other antibodies don't
work well in IP conditions?
I have met multiple occasions where IP only goes one-way... :-/ It could
just be antibody issue. You can try cross link. If that doesn't work, then
move on...
work well in IP conditions?
I have met multiple occasions where IP only goes one-way... :-/ It could
just be antibody issue. You can try cross link. If that doesn't work, then
move on...
c*n
9 楼
换Ab
H9010, stressmarq
magnetic
loading
【在 x*********a 的大作中提到】
: 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
: 我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
: 裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
: buffer， NP-40的浓度时1%。
: immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
: beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
: 我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
: incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
: dye 90度10min中，然后跑胶做western。
: wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
H9010, stressmarq
magnetic
loading
【在 x*********a 的大作中提到】
: 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
: 我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
: 裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
: buffer， NP-40的浓度时1%。
: immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
: beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
: 我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
: incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
: dye 90度10min中，然后跑胶做western。
: wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
x*a
10 楼
我买的Enzo的Hsp90 H90-10的抗体，请问楼主跟stressmarq家的差别很大么？
【在 c*********n 的大作中提到】
: 换Ab
: H9010, stressmarq
:
: magnetic
: loading
【在 c*********n 的大作中提到】
: 换Ab
: H9010, stressmarq
:
: magnetic
: loading
e*s
11 楼
个人感觉：
IP，Co-IP就是拚抗体。
可以优化下条件，做个一抗的Titration（1：20， 1：50， 1：100， 1：200）。再不
行就是换抗体了。
另外增加lysate的量，就是增加细胞了，增加目标蛋白了。把Lysate弄浓点。
IP，Co-IP就是拚抗体。
可以优化下条件，做个一抗的Titration（1：20， 1：50， 1：100， 1：200）。再不
行就是换抗体了。
另外增加lysate的量，就是增加细胞了，增加目标蛋白了。把Lysate弄浓点。
X*n
12 楼
目的蛋白在input中的表达量如何？
x*a
13 楼
表达量蛮高的，现在打算再transfect带tag的蛋白进去用anti-tag 做ip，希望能做出
来。如果楼主做过hsp90跟cdc37的ip，可以把我western的结果发给你看看么
【在 X******n 的大作中提到】
: 目的蛋白在input中的表达量如何？
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