d*i
2 楼
目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？
y*t
3 楼
好靓的菊花。
d*i
4 楼
同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？
k*e
5 楼
nice figure.
【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
d*i
6 楼
同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？
B*e
7 楼
哪里看出来是ＭＭ了？
y*i
8 楼
温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
r*e
9 楼
还真是走光了
【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
y*y
10 楼
有人用TCA的
我自己没试过不知道
我自己没试过不知道
i*l
11 楼
3-4M urea
without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
what you do not want.
i'd discard samples left at RT due to degradation.
without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
what you do not want.
i'd discard samples left at RT due to degradation.
s*y
12 楼
8M urea?
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
z*8
13 楼
我做过这个实验，用液氮ground tissue，然后加点buffer，直接hypotonic lysis了，
感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。
感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。
d*i
14 楼
我是从液氮里直接拿出来的，扔进lysis buffer。。。
【在 y****i 的大作中提到】
: 温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
: 然后再捞出来上lysis buffer
: 要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
: 还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上
d*i
15 楼
确实有很多泡泡，很烦人。
3-4M urea会不会太高了？
【在 i***l 的大作中提到】
: 3-4M urea
: without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
: what you do not want.
: i'd discard samples left at RT due to degradation.
d*i
16 楼
你的意思是先研成干粉，然后加lysis buffer？
【在 z*********8 的大作中提到】
: 我做过这个实验，用液氮ground tissue，然后加点buffer，直接hypotonic lysis了，
: 感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。
d*i
17 楼
里面没有urea啊。。。。。
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 8M urea?
s*y
18 楼
以前我都是这么做的。先在液氮浸泡里磨成干粉，然后直接加lysis buffer煮了。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
i*l
19 楼
i am telling you the trick i used
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better?
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better?
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。
D*A
20 楼
protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。
d*i
21 楼
非常感谢！我也是实在没办法，多加了inhibitor。PMSF也加了。
加了inhibitor的lysis buffer放在冰里遇冷，然后从液氮里拿出tissue，立即
homogenize。。。。
我说的室温过夜是加了6xloading buffer，另外我的buffer里还有2%的SDS，这样也会
降解吗？
【在 D**A 的大作中提到】
: protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
: PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
: glycerol.
: 先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
: 蛋白在室温下过夜会水解。
: 能想到的就这么多了。
h*o
22 楼
我个人感觉用液氮snap freeze以后直接pulverize的效果最好 顺手还可以分成aliquot
然后-80保存， 以后要homogenize 的时候拿出来直接加lysisbuffer
放bullet blender 放在冰柜里面打， 打完以后至少放冰上
protease inhibitor用多了没有什么额外作用
然后-80保存， 以后要homogenize 的时候拿出来直接加lysisbuffer
放bullet blender 放在冰柜里面打， 打完以后至少放冰上
protease inhibitor用多了没有什么额外作用
c*b
23 楼
上点MG132或者MG115？
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western？
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