Redian新闻
>
lysis buffer里加点什么能让tissue在homogenization瞬间蛋白酶就变性了?
avatar
lysis buffer里加点什么能让tissue在homogenization瞬间蛋白酶就变性了?# Biology - 生物学
c*7
1
哦也
avatar
d*i
2
目前在做小肠组织的western,给RIPA buffer把SDS加到2%,然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1:100稀释用的),但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western?
avatar
y*t
3
好靓的菊花。
avatar
d*i
4
同时再问一个问题:
昨天做western,上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了,然
后走的时候忘了收到冰箱,在试验台上放了一晚上。问一下,蛋白会不会降解?
avatar
k*e
5
nice figure.

【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
avatar
d*i
6
同时再问一个问题:
昨天做western,上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了,然
后走的时候忘了收到冰箱,在试验台上放了一晚上。问一下,蛋白会不会降解?
avatar
B*e
7
哪里看出来是MM了?
avatar
y*i
8
温度是关键,一定要迅速降温,整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上

【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western,给RIPA buffer把SDS加到2%,然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1:100稀释用的),但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western?

avatar
r*e
9
还真是走光了

【在 c*******7 的大作中提到】
: 哦也
avatar
y*y
10
有人用TCA的
我自己没试过不知道
avatar
i*l
11
3-4M urea
without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
what you do not want.
i'd discard samples left at RT due to degradation.
avatar
s*y
12

8M urea?

【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western,给RIPA buffer把SDS加到2%,然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1:100稀释用的),但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western?

avatar
z*8
13
我做过这个实验,用液氮ground tissue,然后加点buffer,直接hypotonic lysis了,
感觉效果还可以,不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease, RNAase都比较高。
avatar
d*i
14

我是从液氮里直接拿出来的,扔进lysis buffer。。。

【在 y****i 的大作中提到】
: 温度是关键,一定要迅速降温,整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
: 然后再捞出来上lysis buffer
: 要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
: 还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上

avatar
d*i
15

确实有很多泡泡,很烦人。
3-4M urea会不会太高了?

【在 i***l 的大作中提到】
: 3-4M urea
: without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
: what you do not want.
: i'd discard samples left at RT due to degradation.

avatar
d*i
16

你的意思是先研成干粉,然后加lysis buffer?

【在 z*********8 的大作中提到】
: 我做过这个实验,用液氮ground tissue,然后加点buffer,直接hypotonic lysis了,
: 感觉效果还可以,不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease, RNAase都比较高。

avatar
d*i
17

里面没有urea啊。。。。。

【在 s******y 的大作中提到】
:
: 8M urea?

avatar
s*y
18
以前我都是这么做的。先在液氮浸泡里磨成干粉,然后直接加lysis buffer煮了。

【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。

avatar
i*l
19
i am telling you the trick i used
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better?

【在 d****i 的大作中提到】
:
: 里面没有urea啊。。。。。

avatar
D*A
20
protease inhibitor 加够推荐的量就可以,多加浪费钱,效果还不一定好,可以加点
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷,然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。
avatar
d*i
21

非常感谢!我也是实在没办法,多加了inhibitor。PMSF也加了。
加了inhibitor的lysis buffer放在冰里遇冷,然后从液氮里拿出tissue,立即
homogenize。。。。
我说的室温过夜是加了6xloading buffer,另外我的buffer里还有2%的SDS,这样也会
降解吗?

【在 D**A 的大作中提到】
: protease inhibitor 加够推荐的量就可以,多加浪费钱,效果还不一定好,可以加点
: PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
: glycerol.
: 先用液氮冷,然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
: 蛋白在室温下过夜会水解。
: 能想到的就这么多了。

avatar
h*o
22
我个人感觉用液氮snap freeze以后直接pulverize的效果最好 顺手还可以分成aliquot
然后-80保存, 以后要homogenize 的时候拿出来直接加lysisbuffer
放bullet blender 放在冰柜里面打, 打完以后至少放冰上
protease inhibitor用多了没有什么额外作用
avatar
c*b
23
上点MG132或者MG115?

【在 d****i 的大作中提到】
: 目前在做小肠组织的western,给RIPA buffer把SDS加到2%,然后sigma的protease
: inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1:100稀释用的),但是每次lysate里面
: 都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
: protease还能用于western?

相关阅读
logo
联系我们隐私协议©2024 redian.news
Redian新闻
Redian.news刊载任何文章,不代表同意其说法或描述,仅为提供更多信息,也不构成任何建议。文章信息的合法性及真实性由其作者负责,与Redian.news及其运营公司无关。欢迎投稿,如发现稿件侵权,或作者不愿在本网发表文章,请版权拥有者通知本网处理。