4个片段连接的成功率有多少？# Biology - 生物学
j*x
1 楼
载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
vector
这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率？谢谢！
vector
这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率？谢谢！
s*n
2 楼
加PEG，用电转，colony PCR screening
g*5
3 楼
can you use gibson fragment?
s*s
4 楼
多长啊
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
e*s
5 楼
SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。
s*s
6 楼
加PEG啥的，试一下唄。不成的话，三个insert先连，然后PCR一下，
再和载体搞总行吧
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
再和载体搞总行吧
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
j*x
7 楼
nope，包含大段的重复序列，所以才考虑这种连接方式...
【在 g*********5 的大作中提到】
: can you use gibson fragment?
【在 g*********5 的大作中提到】
: can you use gibson fragment?
j*x
8 楼
载体3kb出头，每个插入约1kb
【在 s******s 的大作中提到】
: 多长啊
【在 s******s 的大作中提到】
: 多长啊
j*x
9 楼
这个有考虑过，但XmaI木有fastdigest版本...
【在 e****s 的大作中提到】
: SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
: 3 way ligation做过不少。4个没弄过。
【在 e****s 的大作中提到】
: SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
: 3 way ligation做过不少。4个没弄过。
j*x
10 楼
PCR没戏，insert1和insert3有大段重复序列，本身就是单独DNA合成出来的。
先试试看吧，不行再一个片段一个片段的整
【在 s******s 的大作中提到】
: 加PEG啥的，试一下唄。不成的话，三个insert先连，然后PCR一下，
: 再和载体搞总行吧
先试试看吧，不行再一个片段一个片段的整
【在 s******s 的大作中提到】
: 加PEG啥的，试一下唄。不成的话，三个insert先连，然后PCR一下，
: 再和载体搞总行吧
m*u
11 楼
Can you use 3-way gateway cloning, if you don't mind a bit junction attB
site between each fragment.
site between each fragment.
x*e
12 楼
克隆genomic sequence？如果是酶切位点不够的话，用gibson cloning
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
s*i
13 楼
做出来过，比三片段低很多，最好不要用blunt end，Xma1 还行，可以先放进去多切一
会儿
三片段大概能做到60%到80%成功率
四段也就10%吧
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
会儿
三片段大概能做到60%到80%成功率
四段也就10%吧
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
x*e
14 楼
好办法，能发个详细protocol link 不 ？ 多谢
【在 s********n 的大作中提到】
: 加PEG，用电转，colony PCR screening
【在 s********n 的大作中提到】
: 加PEG，用电转，colony PCR screening
s*n
15 楼
没有详细的protocol，就是几个要点
1)制备好vector，确保极低自连
2)平末端连接，加PEG
3)加大insert和vector的比例,5:1 to 10:1
4)电转，1E9 to 1E10
5)colony PCR screening，只要高于1%都没问题(96-well plate PCR reactions)，跑
一两个大胶
【在 x*****e 的大作中提到】
: 好办法，能发个详细protocol link 不 ？ 多谢
1)制备好vector，确保极低自连
2)平末端连接，加PEG
3)加大insert和vector的比例,5:1 to 10:1
4)电转，1E9 to 1E10
5)colony PCR screening，只要高于1%都没问题(96-well plate PCR reactions)，跑
一两个大胶
【在 x*****e 的大作中提到】
: 好办法，能发个详细protocol link 不 ？ 多谢
M*g
16 楼
Gibson Assembly from NEB
T*u
17 楼
try Gibson assembly
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
j*x
18 楼
前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
），所以用Gibson Assembly不太合适。
【在 T****u 的大作中提到】
: try Gibson assembly
），所以用Gibson Assembly不太合适。
【在 T****u 的大作中提到】
: try Gibson assembly
s*s
19 楼
我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
j*x
20 楼
yeap,眼下就是打算这么干了。
重复序列就是麻烦，本来想干脆123合在一起一块儿合成了算了，后来看了下价格和交
货时间，还是交给technician去做省钱省时间。当然，首先得保证制定的策略不出大篓
子。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
: 我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
: 然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
重复序列就是麻烦，本来想干脆123合在一起一块儿合成了算了，后来看了下价格和交
货时间，还是交给technician去做省钱省时间。当然，首先得保证制定的策略不出大篓
子。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
: 我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
: 然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接
x*e
21 楼
你不能先把1，3连载体里，再切一刀把2放中间？
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了，由于存在大段重复序列（insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ），所以用Gibson Assembly不太合适。
a*t
22 楼
分成两步克隆效率高多了吧
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
a*a
23 楼
我做过类似的，和你不太一样的是三个片段是合成然后anneal的，都是粘性末端
挺难做的，不过最后还是搞出来了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
挺难做的，不过最后还是搞出来了。
【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率？谢谢！
s*e
24 楼
clontech新出了一个in-fusion system，可能对lz有用，有时间不妨研究一下
e*e
25 楼
you may try GeneArt from invitrogen.
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