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4个片段连接的成功率有多少?
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4个片段连接的成功率有多少?# Biology - 生物学
j*x
1
载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
vector
这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率?谢谢!
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s*n
2
加PEG,用电转,colony PCR screening
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g*5
3
can you use gibson fragment?
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s*s
4
多长啊

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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e*s
5
SmaI可以用XmaI代替,就成Stick end了。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。
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s*s
6
加PEG啥的,试一下唄。不成的话,三个insert先连,然后PCR一下,
再和载体搞总行吧

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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j*x
7
nope,包含大段的重复序列,所以才考虑这种连接方式...

【在 g*********5 的大作中提到】
: can you use gibson fragment?
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j*x
8
载体3kb出头,每个插入约1kb

【在 s******s 的大作中提到】
: 多长啊
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j*x
9
这个有考虑过,但XmaI木有fastdigest版本...

【在 e****s 的大作中提到】
: SmaI可以用XmaI代替,就成Stick end了。
: 3 way ligation做过不少。4个没弄过。

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j*x
10
PCR没戏,insert1和insert3有大段重复序列,本身就是单独DNA合成出来的。
先试试看吧,不行再一个片段一个片段的整

【在 s******s 的大作中提到】
: 加PEG啥的,试一下唄。不成的话,三个insert先连,然后PCR一下,
: 再和载体搞总行吧

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m*u
11
Can you use 3-way gateway cloning, if you don't mind a bit junction attB
site between each fragment.
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x*e
12
克隆genomic sequence?如果是酶切位点不够的话,用gibson cloning

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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s*i
13
做出来过,比三片段低很多,最好不要用blunt end,Xma1 还行,可以先放进去多切一
会儿
三片段大概能做到60%到80%成功率
四段也就10%吧

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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x*e
14
好办法,能发个详细protocol link 不 ? 多谢

【在 s********n 的大作中提到】
: 加PEG,用电转,colony PCR screening
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s*n
15
没有详细的protocol,就是几个要点
1)制备好vector,确保极低自连
2)平末端连接,加PEG
3)加大insert和vector的比例,5:1 to 10:1
4)电转,1E9 to 1E10
5)colony PCR screening,只要高于1%都没问题(96-well plate PCR reactions),跑
一两个大胶

【在 x*****e 的大作中提到】
: 好办法,能发个详细protocol link 不 ? 多谢
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M*g
16
Gibson Assembly from NEB
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T*u
17
try Gibson assembly

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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j*x
18
前面解释过了,由于存在大段重复序列(insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
),所以用Gibson Assembly不太合适。

【在 T****u 的大作中提到】
: try Gibson assembly
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s*s
19
我还以为都同源呢。你1,3同源,先把1,2连起来不就可以做3 frag ligation了?
我当年做200多nt首尾大量同源的片段,还是order了十条五十多单链DNA,
然后1-6一起连,7-10一起连,最后做的3片段连接

【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了,由于存在大段重复序列(insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ),所以用Gibson Assembly不太合适。

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j*x
20
yeap,眼下就是打算这么干了。
重复序列就是麻烦,本来想干脆123合在一起一块儿合成了算了,后来看了下价格和交
货时间,还是交给technician去做省钱省时间。当然,首先得保证制定的策略不出大篓
子。

【在 s******s 的大作中提到】
: 我还以为都同源呢。你1,3同源,先把1,2连起来不就可以做3 frag ligation了?
: 我当年做200多nt首尾大量同源的片段,还是order了十条五十多单链DNA,
: 然后1-6一起连,7-10一起连,最后做的3片段连接

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x*e
21
你不能先把1,3连载体里,再切一刀把2放中间?

【在 j****x 的大作中提到】
: 前面解释过了,由于存在大段重复序列(insert1和insert3有80%的区域是完全一致的
: ),所以用Gibson Assembly不太合适。

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a*t
22
分成两步克隆效率高多了吧

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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a*a
23
我做过类似的,和你不太一样的是三个片段是合成然后anneal的,都是粘性末端
挺难做的,不过最后还是搞出来了。

【在 j****x 的大作中提到】
: 载体外加三个片段,vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
: vector
: 这种连接的效率低是必然的了,而且3’端还是个blunt end(SmaI)。想请教一下有没
: 有什么tips可以提高成功率?谢谢!

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s*e
24
clontech新出了一个in-fusion system,可能对lz有用,有时间不妨研究一下
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e*e
25
you may try GeneArt from invitrogen.
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