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求教一个CRISPR的问题，请高人赐教！万分感谢！

求教一个CRISPR的问题，请高人赐教！万分感谢！# Biology - 生物学

p*i2014-10-16 07:10

1 楼

最近在用CRISPR来删除一部分基因组，就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。
其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了，只说一个问题：
我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然
后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。
CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA
CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA
具体序列保密，不方便透露。两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。
我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点。如果
我做的是瞬转，这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切？如果如此，是不是大
大降低了我得到正确克隆的可能性？是不是可以解释为什么我重复4 5次，筛几百克隆
无一正确的原因？
请大家讨论指教，非常非常感谢！

H*N2014-10-16 07:10

2 楼

"我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点"
这种可能性非常小吧，因为剪切后，连接前，总会有些碱基被削掉

p*i2014-10-16 07:10

3 楼

“这种可能性非常小吧，因为剪切后，连接前，总会有些碱基被削掉"
谢谢楼上的热心解答，您的意思，精确剪切和连接几率很小，大部分还是在切点附近有
碱基增减？

j*i2014-10-16 07:10

4 楼

不正确的克隆是什么样子的？删除一段序列应该不难，但cut之后的非同源重组修复是
不精确的。如果你想得到精确的修复，我觉得应该用加donor同源重组的方法。

d*u2014-10-16 07:10

5 楼

CRISPR引起的DSB是由NHEJ来修理的，这个过程应该说是超级的不精确，删除的碱基数
从几个到10几个到几十个不等。你这个精确剪切的概率应该是非常非常低的。

H*N2014-10-16 07:10

6 楼

yes.碱基只会减不会增。看其他人的回答

【在 p*******i 的大作中提到】

: “这种可能性非常小吧，因为剪切后，连接前，总会有些碱基被削掉"
: 谢谢楼上的热心解答，您的意思，精确剪切和连接几率很小，大部分还是在切点附近有
: 碱基增减？

p*i2014-10-16 07:10

7 楼

非常感谢各位的解答指点。
我太喜欢这个不精确的修剪了。谢谢各位，我可以继续放心去筛了。我以为我需要修
改其中一个CRISPR的序列。
分子生物学的东西博大精深啊，我这种就知道个皮毛的纯生化出身，真是放眼四处皆学
问啊。

Q*i2014-10-16 07:10

8 楼

用过张峰Lab的lenticrispr,效果不错，关键是要挑单克隆
QLJI

s*y2014-10-16 07:10

9 楼

好奇的求问一下：需要全细胞测序来确认被切的位点么？

【在 Q********i 的大作中提到】

: 用过张峰Lab的lenticrispr,效果不错，关键是要挑单克隆
: QLJI

s*r2014-10-16 07:10

10 楼

这个嘛，要看你自己在不在乎了，可以分为三个等级：
1.就想看看phenotype，根本不care off-target，那就只PCR测序target位点。
2.其实不是很care，但是为了发文章，假装care一下，就把预测的几个off-target测一下
3.钱多，干脆能做的都做了再说，那就直接全测

【在 s******y 的大作中提到】

: 好奇的求问一下：需要全细胞测序来确认被切的位点么？

m*z2014-10-16 07:10

11 楼

筛了几百个了？好歹做个PCR看看整个pool里面有没有deletion吧

点。

【在 p*******i 的大作中提到】

: 最近在用CRISPR来删除一部分基因组，就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。
: 其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了，只说一个问题：
: 我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然
: 后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。
: CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA
: CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA
: 具体序列保密，不方便透露。两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。
: 我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点。如果
: 我做的是瞬转，这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切？如果如此，是不是大
: 大降低了我得到正确克隆的可能性？是不是可以解释为什么我重复4 5次，筛几百克隆

m*z2014-10-16 07:10

12 楼

就算发生了再次剪切，也不会把已经delete掉的片段修复回去，你的担心是多余的。看
你描述应该是cutting efficiency太低，找找原因吧，埋头苦筛跟买彩票有啥区别？

【在 p*******i 的大作中提到】

: 非常感谢各位的解答指点。
: 我太喜欢这个不精确的修剪了。谢谢各位，我可以继续放心去筛了。我以为我需要修
: 改其中一个CRISPR的序列。
: 分子生物学的东西博大精深啊，我这种就知道个皮毛的纯生化出身，真是放眼四处皆学
: 问啊。