问个CRISPR作stable cell line的问题： - 未名空间MITBBS历史存档

问个CRISPR作stable cell line的问题：# Biology - 生物学

g*72014-10-22 07:10

1 楼

未来雇主是一个公立大学，
不能sponsor我申绿卡，
但是好像可以提供一些paperwork。
其实自己出钱申，我完全没意见。
但是我记得好像eb2，eb1b是一定要求雇主出钱申请的吧，不允许自己出钱？
谢谢。

d*e2014-10-22 07:10

2 楼

看起来不错，最大的问题是没有USB或是microUSB，而且不知道omap 4470能不能带动
1080p啊

m*D2014-10-22 07:10

3 楼

在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
那位大侠能指点一下？先谢！

b*d2014-10-22 07:10

4 楼

可以自己出钱申请.

s*r2014-10-22 07:10

5 楼

带进去一个selection marker，多筛些clone，应该可以拿到double allele mutation
的。

【在 m*********D 的大作中提到】

: 在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
: 一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
: 改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
: line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
: 大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
: 一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
: 那位大侠能指点一下？先谢！

i*t2014-10-22 07:10

6 楼

这个你找个中国律师问问。只要肯提供paperwork这个其实还是可行的。

【在 g*******7 的大作中提到】

: 未来雇主是一个公立大学，
: 不能sponsor我申绿卡，
: 但是好像可以提供一些paperwork。
: 其实自己出钱申，我完全没意见。
: 但是我记得好像eb2，eb1b是一定要求雇主出钱申请的吧，不允许自己出钱？
: 谢谢。

j*b2014-10-22 07:10

7 楼

肿瘤细胞染色体数大多改变、三倍四倍都有可能、筛选很困难

【在 m*********D 的大作中提到】

: 在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
: 一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
: 改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
: line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
: 大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
: 一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
: 那位大侠能指点一下？先谢！

q*l2014-10-22 07:10

8 楼

eb2自己搞的

l*y2014-10-22 07:10

9 楼

弄个能integrate的virus系统带进去细胞表达，筛一下应该没什么问题

【在 m*********D 的大作中提到】

: 在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
: 一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
: 改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
: line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
: 大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
: 一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
: 那位大侠能指点一下？先谢！

g*72014-10-22 07:10

10 楼

谢谢回复。你说的是NIW么？
我估计学校应该不会让我给它钱，它再帮我付。
再次感谢。

【在 q**l 的大作中提到】

: eb2自己搞的

m*D2014-10-22 07:10

11 楼

是指puro selection吗？我想用的host cell transfection效率是不太高，是想用puro
来筛一下。就是不知道拿到double edited的机会高不高。
谢谢！

mutation

【在 s********r 的大作中提到】

: 带进去一个selection marker，多筛些clone，应该可以拿到double allele mutation
: 的。

g*72014-10-22 07:10

12 楼

自己出钱申请什么样的类型呢？
谢谢答复。

【在 b*****d 的大作中提到】

: 可以自己出钱申请.

m*D2014-10-22 07:10

13 楼

嗯，提醒得好。得看看我的那个host的染色体情况。两个copy就怕了，三个四个不就得
认命了么。：）。谢谢！

【在 j*b 的大作中提到】

: 肿瘤细胞染色体数大多改变、三倍四倍都有可能、筛选很困难

P*12014-10-22 07:10

14 楼

自己出钱只能niw， perm法律上规定必须雇主出，可以manipulate,有风险，不建议，
尤其对于正经雇主，象lz这种正经大学

【在 g*******7 的大作中提到】

: 自己出钱申请什么样的类型呢？
: 谢谢答复。

m*D2014-10-22 07:10

15 楼

你是说用integrated virus把cas9和sgRNA搞进genome吗？
本来是想找个不表达我的基因的细胞系，用CMV来带动mutant表达，就是传统的stable
cell line做法。但担心这种表达的量不好控制，最后也是挑表达量合适的克隆，一样
费事费时。
谢谢！

【在 l***y 的大作中提到】

: 弄个能integrate的virus系统带进去细胞表达，筛一下应该没什么问题

g*72014-10-22 07:10

16 楼

明白，我估计也只能NIW了。

【在 P****1 的大作中提到】

: 自己出钱只能niw， perm法律上规定必须雇主出，可以manipulate,有风险，不建议，
: 尤其对于正经雇主，象lz这种正经大学

s*r2014-10-22 07:10

17 楼

有很多种策略，理论和设计上肯定都是没问题的，效率多少，能不能拿到clone就只有
试了才知道了。

stable

【在 m*********D 的大作中提到】

: 你是说用integrated virus把cas9和sgRNA搞进genome吗？
: 本来是想找个不表达我的基因的细胞系，用CMV来带动mutant表达，就是传统的stable
: cell line做法。但担心这种表达的量不好控制，最后也是挑表达量合适的克隆，一样
: 费事费时。
: 谢谢！

g*72014-10-22 07:10

18 楼

我有PhD，和一些publication，平均水平吧，CS方向
不知道NIW难度多大？

【在 P****1 的大作中提到】

: 自己出钱只能niw， perm法律上规定必须雇主出，可以manipulate,有风险，不建议，
: 尤其对于正经雇主，象lz这种正经大学

m*z2014-10-22 07:10

19 楼

用两个selection marker构建donor plasmid，双杀确保homozygosity

【在 m*********D 的大作中提到】

: 在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
: 一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
: 改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
: line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
: 大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
: 一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
: 那位大侠能指点一下？先谢！

m*D2014-10-22 07:10

20 楼

多谢回复。我还在比较不同的strategy阶段。因为还没有作过，所以，还在“读书”的
阶段。任何input和idea我都谢谢！

【在 s********r 的大作中提到】

: 有很多种策略，理论和设计上肯定都是没问题的，效率多少，能不能拿到clone就只有
: 试了才知道了。
:
: stable

m*D2014-10-22 07:10

21 楼

你这个strategy是指把两个selection marker，象G418/Puro，放在两个Homology-
directed repair template上，只有target gene的两个copy都edited,并且是用不同的
template repair的克隆才会在两种selection条件下生存下来，我理解的对吗？
谢谢！

【在 m*****z 的大作中提到】

: 用两个selection marker构建donor plasmid，双杀确保homozygosity

m*z2014-10-22 07:10

22 楼

exactly

【在 m*********D 的大作中提到】

: 你这个strategy是指把两个selection marker，象G418/Puro，放在两个Homology-
: directed repair template上，只有target gene的两个copy都edited,并且是用不同的
: template repair的克隆才会在两种selection条件下生存下来，我理解的对吗？
: 谢谢！

m*D2014-10-22 07:10

23 楼

看样子你对这个技术比较熟悉。我有一个问题：
在所有我看到的off-target的检测里，都是找genome里和guide RNA sequence相似的地
方，再sequencing。我在想，要是用homology-directed repair的话，只要拿到多个克
隆后，PCR出想target的地方证明达到了目的，把这些克隆的genomic DNA拿出来，几个
restriction enzyme digestion, 再来个Southernblot/hybridization,不就可以证明
是不是只有一个edited位点了吗？总觉得找genome里和guide RNA sequence相似的地方
，再sequencing，并不能排除random insertion的site（当然，random insertion并不
是真正的random,只是需要的homology片断很小而异。）。
谢谢指正！

【在 m*****z 的大作中提到】

: exactly

m*z2014-10-22 07:10

24 楼

off target analysis 是找gRNA引起的 off target digestion 引入的indels
southdernblot是测donor的random integration
两者不是一个东西。
要求严格的话都要做。

【在 m*********D 的大作中提到】

: 看样子你对这个技术比较熟悉。我有一个问题：
: 在所有我看到的off-target的检测里，都是找genome里和guide RNA sequence相似的地
: 方，再sequencing。我在想，要是用homology-directed repair的话，只要拿到多个克
: 隆后，PCR出想target的地方证明达到了目的，把这些克隆的genomic DNA拿出来，几个
: restriction enzyme digestion, 再来个Southernblot/hybridization,不就可以证明
: 是不是只有一个edited位点了吗？总觉得找genome里和guide RNA sequence相似的地方
: ，再sequencing，并不能排除random insertion的site（当然，random insertion并不
: 是真正的random,只是需要的homology片断很小而异。）。
: 谢谢指正！

m*D2014-10-22 07:10

25 楼

谢谢！明白了这两个的区别了。Have a nice day!

【在 m*****z 的大作中提到】

: off target analysis 是找gRNA引起的 off target digestion 引入的indels
: southdernblot是测donor的random integration
: 两者不是一个东西。
: 要求严格的话都要做。

l*s2014-10-22 07:10

26 楼

CRISPR效率还是蛮高的，对于一般cell line两个基因copy不在话下。我们90%的cell两
个拷贝都能敲掉（通过lentivirus infection）。当然这和gRNA关系很大，设计不好
效率会低不少。

【在 m*********D 的大作中提到】

: 在发表的文章里，看到药物治疗过一段时间产生抗药性的病人的肿瘤细胞里，往往会有
: 一些特定的基因突变。考虑用CRISPR技术来模仿这些突变，如某个基因的一个氨基酸的
: 改变，看这个改变是不是真的能使细胞产生抗药性。如果用癌细胞来作stable cell
: line，每个基因会有两个拷贝，而CRISPR技术似乎在一个细胞里edit一个拷贝的机会很
: 大，edit两个拷贝的机会就小得多了。如果只改变一个拷贝的话，这个细胞是不是表达
: 一半WT,一半mutant？那样下面的功能研究可能就会有麻烦了。
: 那位大侠能指点一下？先谢！

m*z2014-10-22 07:10

27 楼

indels很简单，replace就难了

【在 l***s 的大作中提到】

: CRISPR效率还是蛮高的，对于一般cell line两个基因copy不在话下。我们90%的cell两
: 个拷贝都能敲掉（通过lentivirus infection）。当然这和gRNA关系很大，设计不好
: 效率会低不少。

Q*i2014-10-22 07:10

28 楼

也可以考虑敲掉内源基因，再表达突变的外源基因

m*D2014-10-22 07:10

29 楼

先谢谢！再问问题：
lentivirus和普通的lipofectamine transfection比较，除了transfected 的效率高外
，带进去的基因的表达时间会更长久一些吗？在单个细胞里的表达量会高一些吗？lipo
-based的transfection一般是两天后到顶峰，三天后下降。要是virus-based的方法在
单个细胞里的表达量大，表达时间也长一些的话，也许edit两个拷贝的机会就大了。以
前作过lentivirus的shRNA,操作上应该不难。

【在 l***s 的大作中提到】

: CRISPR效率还是蛮高的，对于一般cell line两个基因copy不在话下。我们90%的cell两
: 个拷贝都能敲掉（通过lentivirus infection）。当然这和gRNA关系很大，设计不好
: 效率会低不少。

m*D2014-10-22 07:10

30 楼

也是在考虑之内的strategy。谢谢！
也是最近两年把容易作的课题让给了学生，我自己没project了，一直给学生们打酱油
，才想新开一个面。还得为五斗米折腰几年，把儿子养大。所以，还得动脑子。：（。

【在 Q********i 的大作中提到】

: 也可以考虑敲掉内源基因，再表达突变的外源基因

m*D2014-10-22 07:10

31 楼

是。我还没开始设计了。万一guide RNA的点离replace的点太远的话，Homology-
directed template是直接合成呢还是需要克隆还是问题呢。现在Oligo合成能达到什么
样的长度？IDT合成150 base有问题吗？PAGE的纯花肯定让他们作了。度多少年不作这
些基础试验了。

【在 m*****z 的大作中提到】

: indels很简单，replace就难了

m*z2014-10-22 07:10

32 楼

IDT的gBLOCK很便宜了

【在 m*********D 的大作中提到】

: 是。我还没开始设计了。万一guide RNA的点离replace的点太远的话，Homology-
: directed template是直接合成呢还是需要克隆还是问题呢。现在Oligo合成能达到什么
: 样的长度？IDT合成150 base有问题吗？PAGE的纯花肯定让他们作了。度多少年不作这
: 些基础试验了。

g*52014-10-22 07:10

33 楼

IDT could synthesize 3000bp now.

【在 m*********D 的大作中提到】

: 是。我还没开始设计了。万一guide RNA的点离replace的点太远的话，Homology-
: directed template是直接合成呢还是需要克隆还是问题呢。现在Oligo合成能达到什么
: 样的长度？IDT合成150 base有问题吗？PAGE的纯花肯定让他们作了。度多少年不作这
: 些基础试验了。

l*s2014-10-22 07:10

34 楼

lentivirus会一直表达，效率应该会是最高。不过同时offtarget问题也会更严重,因为
没法turn off.

lipo

【在 m*********D 的大作中提到】

: 先谢谢！再问问题：
: lentivirus和普通的lipofectamine transfection比较，除了transfected 的效率高外
: ，带进去的基因的表达时间会更长久一些吗？在单个细胞里的表达量会高一些吗？lipo
: -based的transfection一般是两天后到顶峰，三天后下降。要是virus-based的方法在
: 单个细胞里的表达量大，表达时间也长一些的话，也许edit两个拷贝的机会就大了。以
: 前作过lentivirus的shRNA,操作上应该不难。

m*D2014-10-22 07:10

35 楼

谢谢manlycz，giantbird05和laghs！和老板讨论下来，准备试试。这个礼拜开始准备
前期工作，测试细胞的puro浓度，但细胞长成clone的一些条件。
同样多谢上面其他网友！