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如何改进 Genomic DNA的PCR
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如何改进 Genomic DNA的PCR# Biology - 生物学
c*e
1
之前听说TSC要容易,但是最近似乎看到板上很多人都说太多人efile到TSC去了,导致
他们处理时间比NSC要长很多。但是现在大家还有看到TSC有比NSC容易通过的趋势么?
我再NSC的辖区,但是公司说TSC容易过,非得帮我efile去TSC。我不知道会不会现在既
不容易过,处理时间还长。。。。那不是得不偿失:(
有谁能给点hint啊。。。。
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y*0
2
最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!
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k*g
3
No PP, No TSC

【在 c****e 的大作中提到】
: 之前听说TSC要容易,但是最近似乎看到板上很多人都说太多人efile到TSC去了,导致
: 他们处理时间比NSC要长很多。但是现在大家还有看到TSC有比NSC容易通过的趋势么?
: 我再NSC的辖区,但是公司说TSC容易过,非得帮我efile去TSC。我不知道会不会现在既
: 不容易过,处理时间还长。。。。那不是得不偿失:(
: 有谁能给点hint啊。。。。

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s*y
4
直接quit了算了
还有比做PCR更简单的活儿吗?

【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!

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c*e
5
晕死,看来得说服公司不往TSC efile啊。。。。nnd

【在 k**********g 的大作中提到】
: No PP, No TSC
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i*l
6
同意,这也看天赋的。你这么问, 的确显示的很不具PCR天赋.

【在 s******y 的大作中提到】
: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗?

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x*3
7
人家说的意思是如果你不pp,你弄不到tsc
tsc还是容易过的

【在 c****e 的大作中提到】
: 晕死,看来得说服公司不往TSC efile啊。。。。nnd
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s*y
8
做个烂PCR也跟天赋扯上了,提质粒是不是也是天赋啊,廓狐还是kit提哦
难怪人说学生物的笨

【在 i***l 的大作中提到】
: 同意,这也看天赋的。你这么问, 的确显示的很不具PCR天赋.
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c*e
9
为啥我公司的律师跟我说,他们会帮我efile到tsc,但是不pp?

【在 x****3 的大作中提到】
: 人家说的意思是如果你不pp,你弄不到tsc
: tsc还是容易过的

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i*l
10
呵呵
随便

【在 s******y 的大作中提到】
: 做个烂PCR也跟天赋扯上了,提质粒是不是也是天赋啊,廓狐还是kit提哦
: 难怪人说学生物的笨

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c*a
11
不pp的话,只能慢慢排队。
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l*e
12
用这个,百试不爽
http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-p

【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!

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x*e
13
PCR是要看基因的吧,不是每个基因都好p,特别是gDNA

【在 s******y 的大作中提到】
: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗?

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Z*5
14
可以出band,但比较模糊的情况下,可以考虑试一下touchdown
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j*n
15
试过常规的optimization没,例如退火温度,可以做个gradient试试或者touchdown
还是不行的话,可以考虑换enzyme或者buffer
推荐epicentre的FailSafe™ PCR PreMix Selection Kit
有12种不同离子强度的buffer 从适合高AT的A buffer到适合高GC的L buffer
对于某些特殊的基因,只有某一种或两种buffer好用 其他的都不行
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s*i
16
+ 10% 5M betain 试试,sigma有卖

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!

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y*0
17
谢谢各位牛人啦!

【在 s*****i 的大作中提到】
: + 10% 5M betain 试试,sigma有卖
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

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x*t
18
加2ul的DMSO试试,或者用GC buffer

【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!

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y*0
19
已经试过DMSO了,没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助,正准备
试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR,是用CRISPR/Cas library lentivirus 感染
后,用PCR扩增integrated gRNA,难度很大啊。谁做过这个screen,可以交流一下。万
分谢谢!

【在 x*******t 的大作中提到】
: 加2ul的DMSO试试,或者用GC buffer
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m*D
20
好多年不作PCR了。上个月也是作genomic PCR,才两三KB,也碰到了同样问题。后来用
NEB的Q5 polymerase加GC enhancer解决。你试试?
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l*e
21
有什么区别么,不就是一个transgene

【在 y*****0 的大作中提到】
: 已经试过DMSO了,没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助,正准备
: 试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR,是用CRISPR/Cas library lentivirus 感染
: 后,用PCR扩增integrated gRNA,难度很大啊。谁做过这个screen,可以交流一下。万
: 分谢谢!

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t*l
22
最简单的方法!换primer
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n*k
23
别理他们,你这个难度估计有哈;不过这种文库的东东BAND应该SHARP吗?
如果从纯优化PCR条件而言,现在完全不值得自己优化条件,换酶,换引物,换体系等
远比优化来的方便;如果是比较特殊的PCR,那一开始就要考虑到选对几个备选的PCR扩
增体系。这些都考虑到了,还需要自己优化的,那就要有对PCR的深入了解和经验了,
建议在周围找一个这样的“牛"人,详细讨论了。

【在 y*****0 的大作中提到】
: 最近在做genomic DNA的PCR,用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction,全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的,不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR?万分感谢!

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m*u
24
genome太大,非特异杂交几率很高,用hotstart PCR。
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