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请教行家:Feng Zhang的genome-wide Screening(CRISPR)后面的deep sequencing
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请教行家:Feng Zhang的genome-wide Screening(CRISPR)后面的deep sequencing# Biology - 生物学
m*D
1
请教行家:Feng Zhang的genome-wide Screening(CRISPR)后面的deep sequencing
对这个很感兴趣。读了几篇相关的文章和screening,前面的library--infection--drug
screening--genomic DNA extraction都懂。后面的deep sequencing部分就糊涂了。
理论上讲,resistant的细胞一定是有基因改变了的,我一直以为挑单克隆,一个一个
去作整个genome测序。仔细读了文章,是药物筛选几天后,细胞pool一起,再作deep
sequence;对照没有drug筛选(Non-resistant)的组,找出那些被CRISPR改变了的gene
,再确认。
几个问题:
1。这个deep sequencing是测(整个)genomic DNA,还是测留下来的guide sequence
(在lentiviral vector上面)?
2。可以测mRNA/cDNA序列来代替genomic DNA吗?突变的基因总该表现在mRNA上(先不
考虑其他类型的RNA)。
3。因为是pool一起的,不是单个克隆,这个sequencing出来的大量数据比较肯定是
bioinformatics方面的工作。这个有公司作没有?
谢谢!
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O*a
2
测guide RNA,因为整合到genome上了。用通用引物扩增,测里面的gRNA序列。比测
mRNA好。
数据分析很简单,因为序列都是知道的,看哪些序列被富集,就是tatget seq 。要的
通量很小的
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m*D
3
大谢!
不记得lentivirus的vector会整合到genome呀。他那个GeCKO v2 vector(包含guide
sequence和Cas9)也能整合进genome吗?
我们有一个自己筛出来的compound,还有一个新的pathway, 所以,想借他的这个思路
,找出这个pathway上的其他蛋白分子。这个思路很不错。
谢谢这里的大侠们。上次来问CRISPR技术,倒是真用这里大侠们提供的方法和思路,作
出了single amino acid的突变(还有几个Nt的突变,引入酶切位点和搞掉PAM,但不改
变amino acid),连两个拷贝都replace的克隆也拿到很多。这里还真酸生物同行的家。
:)。

【在 O**********a 的大作中提到】
: 测guide RNA,因为整合到genome上了。用通用引物扩增,测里面的gRNA序列。比测
: mRNA好。
: 数据分析很简单,因为序列都是知道的,看哪些序列被富集,就是tatget seq 。要的
: 通量很小的

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O*a
4
会整合。GeCKO不是puro筛了几天,再等几天吗
就是让gRNA整合并发挥作用。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到:]
:大谢!

:...........
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O*a
5
v2有两种,一种是cas9和gRNA分开的,先建stable cell line表达cas9,再用lenti-
gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到:]
:大谢!

:...........
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m*D
6
他science文章的protocol里是puromycin七天,然后是drug treatment七天或十四天。
要整合的话(stable cell line),时间是该差不多了。
你说的先作Cas9的stable我要考虑一下。就是作stable cell line太花时间。Cas9的表
达silence问题该不大。一般stable在我手里是三个月之后才出现基因表达走下坡。
Lentivirus感染效率高的话,一个vector省很多事啊。上次作点突变,我用普通的
lipofectamine 3000作transfection, 效率太差,少于10%的细胞能在三天的puromycin
selection后活下来。也许我用的puromycin量太高,2.5ug/ml。当时作了一个三天的
killing,找到能三天杀完host cell的最低量,就用上了。
再向你请教一下:vector整合进genome后,拿到genomic DNA,再用primers来扩增整合
的guide Sequences。这对PCR primers 就是直接从vector来的吗?我想象这对primers
正好在guide sequence的两边,无论vector整合到genome的什么地方,都能把guide
sequence扩增出来。Feng Zhang的文章里把PCR的primers都列了出来。
十分感谢!

【在 O**********a 的大作中提到】
: v2有两种,一种是cas9和gRNA分开的,先建stable cell line表达cas9,再用lenti-
: gRNA感染。另一种是在一个载体上。个人喜欢分开的。
: [在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到:]
: :大谢!
: :
: :...........

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O*a
7
请教真不敢当,你是前辈。
我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
合在一个载体的也可以,如果你喜欢。看你偏好了。
建stable cell line也不难啊,两到三周。
我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章,说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到:]
:他science文章的protocol里是puromycin七天,然后是drug treatment七天或十四天
。要整合的话(stable cell line),时间是该差不多了。

:...........
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m*D
8
大概你的ES长得快。我建一个,至少得一个多月呢。筛选也得两个礼拜到三个礼拜,然
后characterization。上几个月帮一个学生建,他那个细胞长得太慢,doubling time
是两天,结果花了三个月才拿到stable cell lines。
我知道你说的那篇Nature Biotechlogy文章,是老鼠的。也在研究那篇文章。就是这个
sequence部分不太懂。哎,作研究,年龄是大了点,没跟上bioinformatics这些新东西
,越看越糊涂。
谢谢!有问题还会上来找你和其他同行。Have a nice evening!

cas9

【在 O**********a 的大作中提到】
: 请教真不敢当,你是前辈。
: 我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
: 合在一个载体的也可以,如果你喜欢。看你偏好了。
: 建stable cell line也不难啊,两到三周。
: 我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章,说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
: 就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
: [在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到:]
: :他science文章的protocol里是puromycin七天,然后是drug treatment七天或十四天
: 。要整合的话(stable cell line),时间是该差不多了。
: :

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Z*Q
9
耐药不仅和基因突变有关,更和蛋白翻译后修饰相关,磷酸化,泛素化,等等。自噬的
增强就是这些修饰的改变引起的。
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y*m
10
in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
common false positives in any genome-wide screens.

【在 O**********a 的大作中提到】
: 测guide RNA,因为整合到genome上了。用通用引物扩增,测里面的gRNA序列。比测
: mRNA好。
: 数据分析很简单,因为序列都是知道的,看哪些序列被富集,就是tatget seq 。要的
: 通量很小的

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O*a
11
不表达的就不会work,也不会被筛选富集啊
[在 yyadam (sunwind) 的大作中提到:]
:in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
which are
:common false positives in any genome-wide screens.
:...........
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m*D
12
你说的是。但没有一个办法可以找到所有可能的原因,就从这个开始。实际上IP也在考
虑之中。因我前面用CRISPR作了点突变,对这个方面熟悉,老板自然就让我往这方面看
看。如果可能,找到几个cadidates,自然就给实验室打开了及格不同的课题,每个学生
可以作一个感兴趣的方向。而我就是打酱油的:没人愿意作或给实验室打基础的
project,往往就是我来承担。当然,工作也轻松一些,常常没有自己的project.:(。

【在 Z**Q 的大作中提到】
: 耐药不仅和基因突变有关,更和蛋白翻译后修饰相关,磷酸化,泛素化,等等。自噬的
: 增强就是这些修饰的改变引起的。

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m*D
13
你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心:如果CRISPR
function很快,virus进细胞后表达gRNA/Cas9,马上ko了一个pathway上的基因,3天的
puromycin selection期间,没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以,我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了,找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大,估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor,
所以,就想自己试试。
谢谢!

gRNA

【在 y****m 的大作中提到】
: in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of gRNA
: integrated as some integrated gRNA virus won't express at all, which are
: common false positives in any genome-wide screens.

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O*a
14
这种不整合又有功能的几率是很小的吧。漏掉了没关系。
细胞MOI控制在0.3,目的是尽可能的每个细胞一个病毒一个gRNA,所以起始量也得大一
点吧。
我用过50X10^6个细胞。记得他文章是100X10^6个细胞吧。

【在 m*********D 的大作中提到】
: 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心:如果CRISPR
: function很快,virus进细胞后表达gRNA/Cas9,马上ko了一个pathway上的基因,3天的
: puromycin selection期间,没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以,我以
: 为sequencing整个genome来找呢。
: 既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
: 的signal transduction的“网络”已经很成熟了,找到几个估计就会有谱了。看了
: Feng zhang的method section,细胞用量很大,估计是不是考虑了整合进genome的效率
: 不是很高这个因素。
: 我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor,
: 所以,就想自己试试。

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m*D
15
严格地说,我不知道“不整合又有功能的几率”。你的ES可能integration的概率高一
些,我以前作过knockout老鼠的stem cell。平常用cnacer cell line作stable,反正拿
到的效率很低。除了transfection的效率低,integration的概率低可能也是原因。
他那个300X的library coverage,不知道是不是考虑到这个因素,我的理解是每个guide
RNA有300个机会(转进细胞),加上一个gene有三个guide sequences,就是每个基因
平均有900的机会,这样也许能compensate integration的概率低?我的瞎理解。
100M的细胞,大约是10个T75 flask,我应该能对付。:)。

【在 O**********a 的大作中提到】
: 这种不整合又有功能的几率是很小的吧。漏掉了没关系。
: 细胞MOI控制在0.3,目的是尽可能的每个细胞一个病毒一个gRNA,所以起始量也得大一
: 点吧。
: 我用过50X10^6个细胞。记得他文章是100X10^6个细胞吧。

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O*a
16
发个邮件或者去他那个google group论坛上问他。feng zhang人很好,会回答或者他的
手下会回答的。
https://groups.google.com/forum/#!forum/crispr

guide

【在 m*********D 的大作中提到】
: 严格地说,我不知道“不整合又有功能的几率”。你的ES可能integration的概率高一
: 些,我以前作过knockout老鼠的stem cell。平常用cnacer cell line作stable,反正拿
: 到的效率很低。除了transfection的效率低,integration的概率低可能也是原因。
: 他那个300X的library coverage,不知道是不是考虑到这个因素,我的理解是每个guide
: RNA有300个机会(转进细胞),加上一个gene有三个guide sequences,就是每个基因
: 平均有900的机会,这样也许能compensate integration的概率低?我的瞎理解。
: 100M的细胞,大约是10个T75 flask,我应该能对付。:)。

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m*D
17
大谢!发贴前可以先读不少东西!

【在 O**********a 的大作中提到】
: 发个邮件或者去他那个google group论坛上问他。feng zhang人很好,会回答或者他的
: 手下会回答的。
: https://groups.google.com/forum/#!forum/crispr
:
: guide

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y*m
18
In a ideal world, yes. In reality, no.
plus, it will increase noise in T0

【在 O**********a 的大作中提到】
: 不表达的就不会work,也不会被筛选富集啊
: [在 yyadam (sunwind) 的大作中提到:]
: :in fact, it better to sequence RNA of expressed gRNA instead of DNA of
: gRNA integrated as some integrated gRNA virus won't express at all,
: which are
: :common false positives in any genome-wide screens.
: :...........

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