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QuikChange，没有colony，咋办？
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QuikChange，没有colony，咋办？# Biology - 生物学
d*f
1 楼
【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 被下贱男分手，成内伤
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 5 13:09:28 2011, 美东)
好吧，我们分手是在9月4日，你们在一起是在8月6日。
好吧，你说我和我分手是不想耽误我，你对你在芝加哥找到工作没信心，不想让我两年
（加上OPT时间）以后再不得不放弃。谢谢，你对我太好了。所以找了个国内的，然后
你的目标还是努力在美国找工作的。你为了不祸害我去祸害人家，我很感动！
好吧，你说不想在没有事业的时候和我结婚，所以怕耽误我。这个问题不是一直存在么
？我们在一起的时候你都不怕，你出轨后就害怕了。真是出轨使人智慧啊。
好吧，你还说我哪都好，不是你不要了，是你要不起。也对啊，在你出轨后，你哪里要
得起。不过在你为什么出轨，我还是没想明白。如果你想骂我一顿，告诉我我哪不好了
，我会特别感激的。好歹解了我心中的疑惑，也让我以后能改。
好吧，你说要我不要抠痘痘了，这么漂亮的脸怎么不爱惜呢。你爱惜了么？留这你的爱
惜去给你的下一个女人漂亮的脸吧。
好吧，你告诉我你爱我比我爱你更多，我不够在乎你。我想跟你说我真的忙的很，我对
我爸我妈都没和你联系的这么多。你要是想要更多的关心你可以告诉我啊，我还以为这
样的联系程度你OK呢。不过换过来想一下你关心过我了么？我的工作很容易么？一次我
加班翻译重要的合同条款到晚上10点多才去吃饭，翻出的东西被批：还是美国念过书的
呢，你是中文不好还是不懂英文，有这样说中文的人的么？我看了他改过后的翻译说，
我知道怎么翻译了，我原先翻的太直译了。我相信短期内我可以达到你希望的水平。然
后接下来的翻译我都很用心很紧张，终于被夸翻译的真好了。这样的事还有很多，包括
一直觉得自己的英语不够好，一直一直在努力。你问我为什么不告诉你？你问我了么？
你以为我找了个好工作是个终点么？你可以爱我的找了下一个。还想让我相信因为我不
够爱你，然后你默默的忍受这一切，不告诉我舍不得让我知道，所以你找的下一个？你
当我是白痴还是弱智？
好吧，在你短暂的23岁生命中你出轨过3次。你的生命真是很精彩嘛。我脑袋一定被驴
踢了，相信你前2次是因为你的原gf自私凶武断。那么我是不是以后也会是个特别负面
的形象呢？呵呵，太好奇了，我是什么样的负面形象快告诉我啊，其实我真的很想知道
呢。
好吧，其实我还是很讲理的，我知道是你招惹她的。我不会试图去联系她，也不会找她
麻烦。我相信以后你带给她的麻烦会远远比我费尽脑汁找的麻烦精彩。
好吧，你说你当然更爱我，我怎么感觉不到呢。我当然感觉不到了，你和我分手和她在
一起，你说你更爱谁？
好吧，你说你见到我时就开始后悔了。我说你要是后悔你们就分手吧，就当你赎罪。
好吧，你说你羡慕谁谁谁，和我分手后还能继续做朋友。我和他是和平分手好不好？你
要是为了我和你的新女人分手，我会和你做很好的朋友的，因为这样能证明你还是可信
的，有情有义的。你能么？不能。那就别装羡慕了。
好吧，我说如果你更爱我，你就跟她分手。这样我会相信你确实爱我，在忏悔。不然我
不知道怎么面对你们的恩爱，就让我们老死不相往来吧。
好吧，你说我怎么能让你做这么艰难的选则。我怎么就不知道你有多在乎我。你在我还
不知道到底发生了什么的时候，要我主动选择和你分手，你还是个可怜的不被原谅的被
分手的形象。我的选择很容易啊，我做选择做的很开心是不是？
好吧，你这么久这么困难的选则，让我很不忍心呢。我帮你选择吧，就像我帮你选则我
们分手一样。如果你真的爱过我，我最后一个请求就是，让我们老死不相往来吧。
好吧，我知道我这篇日志也许太泼了，反正我骂爽了我就开心多了，不然委屈憋着我会
内伤的。并且希望WSN们看了这篇日志以后通通离我远远的，在想追我的时候掂量下自
己的胆量。阿弥陀佛。Thank Goodness。阿门。等等等等。其实我是想拜托各位神仙以
后WSN贱男离我远远的，可惜我只知道这3个，剩下的只好放在等等等等中。
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B*v
2 楼
我用QuikChange做mutaion，成功率70%的样子。其余30%没有colony,
该咋办，有经验的大师给指点一下。
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k*i
3 楼
求摘要
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C*e
4 楼
给的信息太少了，很难帮你trouble shoot啊
引物的设计，质粒的大小，做模版的质粒是否新鲜，一个点还是几个点同时突变....
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m*e
5 楼
标题？

【在 k**********i 的大作中提到】
: 求摘要
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b*e
7 楼
哈哈，不错

【在 d********f 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
: 发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
: 标 题: 被下贱男分手，成内伤
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 5 13:09:28 2011, 美东)
: 好吧，我们分手是在9月4日，你们在一起是在8月6日。
: 好吧，你说我和我分手是不想耽误我，你对你在芝加哥找到工作没信心，不想让我两年
: （加上OPT时间）以后再不得不放弃。谢谢，你对我太好了。所以找了个国内的，然后
: 你的目标还是努力在美国找工作的。你为了不祸害我去祸害人家，我很感动！
: 好吧，你说不想在没有事业的时候和我结婚，所以怕耽误我。这个问题不是一直存在么
: ？我们在一起的时候你都不怕，你出轨后就害怕了。真是出轨使人智慧啊。
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x*e
8 楼
直接合成DNA嘛

【在 B***v 的大作中提到】
: 我用QuikChange做mutaion，成功率70%的样子。其余30%没有colony,
: 该咋办，有经验的大师给指点一下。
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k*i
9 楼
你哈哈，笑点在哪儿啊
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B*v
10 楼
没钱，有的是时间

【在 x********e 的大作中提到】
: 直接合成DNA嘛
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o*1
11 楼
芝加哥美女，是谁呢？。。。

【在 d********f 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
: 发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
: 标 题: 被下贱男分手，成内伤
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 5 13:09:28 2011, 美东)
: 好吧，我们分手是在9月4日，你们在一起是在8月6日。
: 好吧，你说我和我分手是不想耽误我，你对你在芝加哥找到工作没信心，不想让我两年
: （加上OPT时间）以后再不得不放弃。谢谢，你对我太好了。所以找了个国内的，然后
: 你的目标还是努力在美国找工作的。你为了不祸害我去祸害人家，我很感动！
: 好吧，你说不想在没有事业的时候和我结婚，所以怕耽误我。这个问题不是一直存在么
: ？我们在一起的时候你都不怕，你出轨后就害怕了。真是出轨使人智慧啊。
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M*g
12 楼
Try NEB Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit https://www.neb.com/products
/e0554-q5-site-directed-mutagenesis-kit). It is much much better than the
quick change. They also have a web tool to help you design the primers: http://nebasechanger.neb.com/. Very convenient.
Make sure to use their comp cells. if you use comp cells from other
companies, dilute your final rxn (1:3), then do the transformation.
If your plasmid is big such as 8 kb, I normally double the denaturing time
as NEB suggest.
Another experience using the NEB kit is: do not spread too much
transformation outgrowth, otherwise you will get too many colonies on the
plate. I normally spread 10-20 ul (out of 500 ul outgrowth).
I've used quick change for many years, but after I found NEB kit, I tossed
the quick change.
Hope this helps. Good luck.
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o*1
13 楼
仔细看了一遍，发现美女真的内伤了，不宜发joke。

【在 d********f 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
: 发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
: 标 题: 被下贱男分手，成内伤
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 5 13:09:28 2011, 美东)
: 好吧，我们分手是在9月4日，你们在一起是在8月6日。
: 好吧，你说我和我分手是不想耽误我，你对你在芝加哥找到工作没信心，不想让我两年
: （加上OPT时间）以后再不得不放弃。谢谢，你对我太好了。所以找了个国内的，然后
: 你的目标还是努力在美国找工作的。你为了不祸害我去祸害人家，我很感动！
: 好吧，你说不想在没有事业的时候和我结婚，所以怕耽误我。这个问题不是一直存在么
: ？我们在一起的时候你都不怕，你出轨后就害怕了。真是出轨使人智慧啊。
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B*v
14 楼
I'll check it out. Never used it. But sounds so good based on your
experience.
Denaturing time doesn't seem to be an issue as other mutations worked using
the same template.
春节快乐！

products

【在 M******g 的大作中提到】
: Try NEB Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit https://www.neb.com/products
: /e0554-q5-site-directed-mutagenesis-kit). It is much much better than the
: quick change. They also have a web tool to help you design the primers: http://nebasechanger.neb.com/. Very convenient.
: Make sure to use their comp cells. if you use comp cells from other
: companies, dilute your final rxn (1:3), then do the transformation.
: If your plasmid is big such as 8 kb, I normally double the denaturing time
: as NEB suggest.
: Another experience using the NEB kit is: do not spread too much
: transformation outgrowth, otherwise you will get too many colonies on the
: plate. I normally spread 10-20 ul (out of 500 ul outgrowth).
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f*r
15 楼
friends with benefits?
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h*r
16 楼
gibson assembly方便多了吧。
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r*e
17 楼
这也叫出轨?!

【在 d********f 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
: 发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
: 标 题: 被下贱男分手，成内伤
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 5 13:09:28 2011, 美东)
: 好吧，我们分手是在9月4日，你们在一起是在8月6日。
: 好吧，你说我和我分手是不想耽误我，你对你在芝加哥找到工作没信心，不想让我两年
: （加上OPT时间）以后再不得不放弃。谢谢，你对我太好了。所以找了个国内的，然后
: 你的目标还是努力在美国找工作的。你为了不祸害我去祸害人家，我很感动！
: 好吧，你说不想在没有事业的时候和我结婚，所以怕耽误我。这个问题不是一直存在么
: ？我们在一起的时候你都不怕，你出轨后就害怕了。真是出轨使人智慧啊。
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g*c
18 楼
要用好quichchange应该看看下面这篇paper.
Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(2):e12. doi: 10.1093/nar/gku1189. Epub 2014
Nov 15.
New insights into the QuikChange™ process guide the use of Phusion DNA
polymerase for site-directed mutagenesis.
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k*2
19 楼
同居过程中也叫出轨吧。。。

【在 r*********e 的大作中提到】
: 这也叫出轨?!
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m*o
20 楼
成功率70%难道不是很高嘛？
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i*a
21 楼
好吧

【在 k**********i 的大作中提到】
: 求摘要
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B*v
22 楼
不是还有30% fail嘛
我会试一下上面推荐的Q5

【在 m******o 的大作中提到】
: 成功率70%难道不是很高嘛？
avatar
T*U
23 楼
被驴踢成内伤。

【在 k**********i 的大作中提到】
: 求摘要
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m*o
24 楼
我们都是直接用Q5 polymerase，不用KIT，就是再普通PCR的基础上稍微调调参数就可
以了。
然后挑5-6个colonies,能搞到1-2个正确的就可以了

【在 B***v 的大作中提到】
: 不是还有30% fail嘛
: 我会试一下上面推荐的Q5
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o*1
25 楼
君不闻北骡南驴，都是一等一的脚力。

【在 T*U 的大作中提到】
: 被驴踢成内伤。
avatar
B*v
26 楼
回来汇报一下，3个用QuikChange不成功的mutation，用Q5一举成功，看来QuikChange
可以扔了
多谢宝盖俄州同学指点
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x*s
27 楼
美女还是没看开
看开就不会写这么多了
去他妈的男人，自己好好活着就是了
avatar
o*1
28 楼
I aglee. But this is just one side of the story. The other side may look
completely different, anyway ...

【在 x**********s 的大作中提到】
: 美女还是没看开
: 看开就不会写这么多了
: 去他妈的男人，自己好好活着就是了
avatar
x*s
29 楼
什么另外一面？

【在 o******1 的大作中提到】
: I aglee. But this is just one side of the story. The other side may look
: completely different, anyway ...
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