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克隆splicing isoform的套路

克隆splicing isoform的套路# Biology - 生物学

j*i2016-03-11 08:03

1 楼

爱好种东西, 但是手指太黑了, 绝对理想黑体级别的
0. 葡萄树, 前房主留下的, 7个只活了一个
1. 树莓, 先后买了5颗, 只有一颗还苟延残息, 其他全死了
2. 柿子树, 主杆先后断了2次, 3年了, 还只有2尺高
3. 桃树, 去年水浇多, 淹死了
4. hardy kiwi, 今年种的, 肥放多, 死了
5. 其他苹果, 樱桃虽然还活着, 一年比一年结果少.

k*n2016-03-11 08:03

2 楼

还不趁着人们新鲜自己的手机捞一笔？
一点信都没有

s*92016-03-11 08:03

3 楼

Evidence for isoforms:
1: western blot shows two bands.
2: both bands sensitive to siRNA-1, only one band sensitive to siRNA-2.
the isoforms listed in Genebank do not explain these observations, which
suggests a new isoform. What would be the routine experiment to identify
this new isoform?
Thanks a lot.

l*d2016-03-11 08:03

4 楼

你太牛了，说说肿么把葡萄给种死的？

K*a2016-03-11 08:03

5 楼

光卖手机就够他们喝一壶了，再整个charging orb让人抢，你是嫌google服务器太好了
还是怎的……

T*e2016-03-11 08:03

6 楼

坐等大神解答。
如果你有一个抗体只能识别siRNA-2的目标区，并且用这个抗体做WB只剩一条带。我觉
得我会更相信一些。
说的不对请见谅。

j*i2016-03-11 08:03

7 楼

第一年接了不少, 就是果子很小, 没法吃
然后冬天修剪了一下,
来年春天就挂了.

【在 l*********d 的大作中提到】

: 你太牛了，说说肿么把葡萄给种死的？

l*y2016-03-11 08:03

8 楼

做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？

【在 s********9 的大作中提到】

: Evidence for isoforms:
: 1: western blot shows two bands.
: 2: both bands sensitive to siRNA-1, only one band sensitive to siRNA-2.
: the isoforms listed in Genebank do not explain these observations, which
: suggests a new isoform. What would be the routine experiment to identify
: this new isoform?
: Thanks a lot.

t*x2016-03-11 08:03

9 楼

葡萄应该在1月中二月初的时候修剪，你什么时候剪的？

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 j****i 的大作中提到】

: 第一年接了不少, 就是果子很小, 没法吃
: 然后冬天修剪了一下,
: 来年春天就挂了.

s*92016-03-11 08:03

10 楼

The reported mRNA isoform should be targeted by both siRNAs.
The unreported one is insensitive to siRNA-2. I should've made it clear.

【在 l***y 的大作中提到】

: 做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
: 话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？

j*i2016-03-11 08:03

11 楼

具体记不清了, 去年的事情, 但是差不多就是那个时候.

【在 t*****x 的大作中提到】

: 葡萄应该在1月中二月初的时候修剪，你什么时候剪的？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

z*k2016-03-11 08:03

12 楼

targeted RNA-seq.

t*x2016-03-11 08:03

13 楼

还有施肥，最好都在早春施，如果晚春到夏天施肥它就很容易冻死

【在 j****i 的大作中提到】

: 具体记不清了, 去年的事情, 但是差不多就是那个时候.

s*92016-03-11 08:03

14 楼

j*i2016-03-11 08:03

15 楼

在湾区, 现在还可以给果树, 草莓, 西红柿什么的施肥吗?
想给坚强活着的加点营养

【在 t*****x 的大作中提到】

: 还有施肥，最好都在早春施，如果晚春到夏天施肥它就很容易冻死

T*e2016-03-11 08:03

16 楼

坐等大神解答。
如果你有一个抗体只能识别siRNA-2的目标区，并且用这个抗体做WB只剩一条带。我觉
得我会更相信一些。
说的不对请见谅。

l*d2016-03-11 08:03

17 楼

还是歇歇吧！或许还可以继续活着。

【在 j****i 的大作中提到】

: 在湾区, 现在还可以给果树, 草莓, 西红柿什么的施肥吗?
: 想给坚强活着的加点营养

l*y2016-03-11 08:03

18 楼

做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？

【在 s********9 的大作中提到】

s*92016-03-11 08:03

19 楼

The reported mRNA isoform should be targeted by both siRNAs.
The unreported one is insensitive to siRNA-2. I should've made it clear.

【在 l***y 的大作中提到】

: 做全长mRNA的RT，或者单独把siRNA2的binding区RT-PCR弄出来去测序
: 话说不是啥重要蛋白的isoform有人关心吗？

z*k2016-03-11 08:03

20 楼

targeted RNA-seq.

n*72016-03-11 08:03

21 楼

...大炮打蚊子
做个sanger就好了

【在 z***k 的大作中提到】

: targeted RNA-seq.

n*72016-03-11 08:03

22 楼

可以预测一下siRNA-2的target site
然后看在哪个exon上
可能是exon skipping的事件
这是最简单的情况
复杂的就很复杂了
你可以测序验证
如果是有生物功能的isoform的话还是有点意思的

【在 s********9 的大作中提到】

: The reported mRNA isoform should be targeted by both siRNAs.
: The unreported one is insensitive to siRNA-2. I should've made it clear.

s*92016-03-11 08:03

23 楼

I know the sequence of both siRNA.
I want to clone this unrecognized isoform and express it to study its
function.
BTW, how do I do sanger seq to get the seq of unrecognized siRNA-insensitive
isofrm? (product is smaller than all reported isoforms)
And can Mass Spectrometry identify the sequence of this unrecognized isoform
(let's call short form)?
WHat i worry about is the contamination from reported isoform (let's call
full length)

【在 n******7 的大作中提到】

: 可以预测一下siRNA-2的target site
: 然后看在哪个exon上
: 可能是exon skipping的事件
: 这是最简单的情况
: 复杂的就很复杂了
: 你可以测序验证
: 如果是有生物功能的isoform的话还是有点意思的

n*72016-03-11 08:03

24 楼

1. 最好先根据siRNA的靶点估测一下这个isoform的序列构成
在某个coding exon上面最好
2. 如果大致确定是alternative splicing，而不是5'-/3'-的变化
可以根据全长isoform 的ORF设计引物做RT-PCR
如果这个short-form 表达量不是特别低的话
做一定数量的clone就可以抓住了
后续你怎么玩都可以了
3. 可以同时做一些bioinfo的分析
比如这个AS event很可能对应新的splicing junction
可以看一下已有的RNA-Seq data里面这个junction的表达情况
由此可以大致推断这个isoform是不是functional的
另外，也可以居然protein sequence的变化，看看是不是有些domain被打乱了
这样的话有可能跟全长蛋白功能相反的，这是比较有意思的一种情况

insensitive
isoform

【在 s********9 的大作中提到】

: I know the sequence of both siRNA.
: I want to clone this unrecognized isoform and express it to study its
: function.
: BTW, how do I do sanger seq to get the seq of unrecognized siRNA-insensitive
: isofrm? (product is smaller than all reported isoforms)
: And can Mass Spectrometry identify the sequence of this unrecognized isoform
: (let's call short form)?
: WHat i worry about is the contamination from reported isoform (let's call
: full length)