X*7
2 楼
中国年，念念不忘就是年夜饭。都好久没正规的撮一顿正宗的团圆饭了，你们说，我要
是毛遂自荐的去中国餐厅参加那些不相识人士的聚餐，会有多少人拿砖拍我呀？咳，我
就想要个气氛，也不准备去混吃混喝的，份子钱绝对会自觉缴纳的。。。我这两天一直
在琢磨着这件事的可行性，大伙探讨探讨，看看可行不可行。
是毛遂自荐的去中国餐厅参加那些不相识人士的聚餐，会有多少人拿砖拍我呀？咳，我
就想要个气氛，也不准备去混吃混喝的，份子钱绝对会自觉缴纳的。。。我这两天一直
在琢磨着这件事的可行性，大伙探讨探讨，看看可行不可行。
P*e
3 楼
【 以下文字转载自 Seattle 讨论区 】
发信人: edao (老牛), 信区: Seattle
标 题: 新说道与德
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 17 16:59:47 2009, 美东)
（三）
书名当然就是道德经啦。按现在的话可以叫道与德论。道与德原来不是一个词，也各有
所指，古代为了环保省竹子就省了一个“与”字。以前有的书叫作经，现在出的书没有
叫经的，（除了“神经”学） 所以按现在的方法叫论吧。
发信人: edao (老牛), 信区: Seattle
标 题: 新说道与德
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 17 16:59:47 2009, 美东)
（三）
书名当然就是道德经啦。按现在的话可以叫道与德论。道与德原来不是一个词，也各有
所指，古代为了环保省竹子就省了一个“与”字。以前有的书叫作经，现在出的书没有
叫经的，（除了“神经”学） 所以按现在的方法叫论吧。
j*8
4 楼
一月份的时候没换， 眼睁睁看着那个免费的手机变成了49.99. 然后就是现在要换有些
手机的时候要强制收10块钱一个月了。 看网上大家说9号会有新机型。 但是有点担心
那时候不仅不能免费买新机子，反而要口袋多掏钱。 大家怎么看啊？
手机的时候要强制收10块钱一个月了。 看网上大家说9号会有新机型。 但是有点担心
那时候不仅不能免费买新机子，反而要口袋多掏钱。 大家怎么看啊？
C*e
5 楼
rt
想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
大量（50-100ml）
想按照蛋白大小快速粗分离
比如30kDa左右为分界
有没有什么好方法？
想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
大量（50-100ml）
想按照蛋白大小快速粗分离
比如30kDa左右为分界
有没有什么好方法？
h*o
6 楼
DS 160表里面有一项问" Do you have any specialized skills or training, such
as firearm, explosive, unclear, biological, or chemical experience? "
请问如果是生物专业和化学专业的，就必须填"yes"吗？感觉生物和化学跟武器，核专
业，爆炸专业放在一起好奇怪的，不知道怎么填比较好。能否指点一下？非常感谢！万
谢！
as firearm, explosive, unclear, biological, or chemical experience? "
请问如果是生物专业和化学专业的，就必须填"yes"吗？感觉生物和化学跟武器，核专
业，爆炸专业放在一起好奇怪的，不知道怎么填比较好。能否指点一下？非常感谢！万
谢！
UA
7 楼
yes
o*1
8 楼
今天有十个左右庆祝春节的亚洲人，邀请了我，但其中混了一个法国人，一个俄国人
，一个德国人。
【在 X******7 的大作中提到】
: 中国年，念念不忘就是年夜饭。都好久没正规的撮一顿正宗的团圆饭了，你们说，我要
: 是毛遂自荐的去中国餐厅参加那些不相识人士的聚餐，会有多少人拿砖拍我呀？咳，我
: 就想要个气氛，也不准备去混吃混喝的，份子钱绝对会自觉缴纳的。。。我这两天一直
: 在琢磨着这件事的可行性，大伙探讨探讨，看看可行不可行。
，一个德国人。
【在 X******7 的大作中提到】
: 中国年，念念不忘就是年夜饭。都好久没正规的撮一顿正宗的团圆饭了，你们说，我要
: 是毛遂自荐的去中国餐厅参加那些不相识人士的聚餐，会有多少人拿砖拍我呀？咳，我
: 就想要个气氛，也不准备去混吃混喝的，份子钱绝对会自觉缴纳的。。。我这两天一直
: 在琢磨着这件事的可行性，大伙探讨探讨，看看可行不可行。
w*1
9 楼
不用担心，那个十块钱是跑不掉的。
【在 j*******8 的大作中提到】
: 一月份的时候没换， 眼睁睁看着那个免费的手机变成了49.99. 然后就是现在要换有些
: 手机的时候要强制收10块钱一个月了。 看网上大家说9号会有新机型。 但是有点担心
: 那时候不仅不能免费买新机子，反而要口袋多掏钱。 大家怎么看啊？
【在 j*******8 的大作中提到】
: 一月份的时候没换， 眼睁睁看着那个免费的手机变成了49.99. 然后就是现在要换有些
: 手机的时候要强制收10块钱一个月了。 看网上大家说9号会有新机型。 但是有点担心
: 那时候不仅不能免费买新机子，反而要口袋多掏钱。 大家怎么看啊？
s*y
10 楼
1. memrane filter? I would recommend using the inverted filter set in order
to protect the activities of the proteins.
2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
3. a short, fat, gel filtration column?
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
to protect the activities of the proteins.
2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
3. a short, fat, gel filtration column?
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
s*u
11 楼
不记得了，我好像填的no
X*7
12 楼
你怎么就这么幸运呢，10个你也去不了呀，快点，派代表参加，咱俩要是住的近，我就
当你的其中几个代表了，早中晚可分3次。
【在 o******1 的大作中提到】
: 今天有十个左右庆祝春节的亚洲人，邀请了我，但其中混了一个法国人，一个俄国人
: ，一个德国人。
当你的其中几个代表了，早中晚可分3次。
【在 o******1 的大作中提到】
: 今天有十个左右庆祝春节的亚洲人，邀请了我，但其中混了一个法国人，一个俄国人
: ，一个德国人。
j*8
13 楼
唉， 刚看前半句还准备松口气呢， 谁知道原来。。。。。
C*e
14 楼
membrane filter会不会很贵？刚才看了spectrum labs公司的，没有30 kDa的选择，只有
20kDa，或是50kDa的。
透析有个25 kda的，但是不确定到底要花多久
有又粗又短的gel filtration column存在么？不管怎么说50ml都是比较大的体积了
不清楚是不是有什么old school的方法
order
【在 s******y 的大作中提到】
: 1. memrane filter? I would recommend using the inverted filter set in order
: to protect the activities of the proteins.
: 2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
: 3. a short, fat, gel filtration column?
20kDa，或是50kDa的。
透析有个25 kda的，但是不确定到底要花多久
有又粗又短的gel filtration column存在么？不管怎么说50ml都是比较大的体积了
不清楚是不是有什么old school的方法
order
【在 s******y 的大作中提到】
: 1. memrane filter? I would recommend using the inverted filter set in order
: to protect the activities of the proteins.
: 2. high speed centrifugation with sucrose cushion?
: 3. a short, fat, gel filtration column?
n*n
15 楼
当然填NO
最近回国签证被check的几率很搞。即使H1-b的也是，好好准备
最近回国签证被check的几率很搞。即使H1-b的也是，好好准备
X*7
16 楼
你这说的是个10几人的聚餐？可能理解失误，咳，有比无总是强了很多的。
【在 X******7 的大作中提到】
: 你怎么就这么幸运呢，10个你也去不了呀，快点，派代表参加，咱俩要是住的近，我就
: 当你的其中几个代表了，早中晚可分3次。
【在 X******7 的大作中提到】
: 你怎么就这么幸运呢，10个你也去不了呀，快点，派代表参加，咱俩要是住的近，我就
: 当你的其中几个代表了，早中晚可分3次。
w*1
17 楼
能换个好手机，每个月10块还是划得来的，少吃半顿buffet嘛。
再说，就算40一个月，还是很便宜啊。
【在 j*******8 的大作中提到】
: 唉， 刚看前半句还准备松口气呢， 谁知道原来。。。。。
再说，就算40一个月，还是很便宜啊。
【在 j*******8 的大作中提到】
: 唉， 刚看前半句还准备松口气呢， 谁知道原来。。。。。
r*o
18 楼
millipore ultrafree filter devices
60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
。。。
60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
。。。
c*t
19 楼
Yes
【在 h*******o 的大作中提到】
: DS 160表里面有一项问" Do you have any specialized skills or training, such
: as firearm, explosive, unclear, biological, or chemical experience? "
: 请问如果是生物专业和化学专业的，就必须填"yes"吗？感觉生物和化学跟武器，核专
: 业，爆炸专业放在一起好奇怪的，不知道怎么填比较好。能否指点一下？非常感谢！万
: 谢！
【在 h*******o 的大作中提到】
: DS 160表里面有一项问" Do you have any specialized skills or training, such
: as firearm, explosive, unclear, biological, or chemical experience? "
: 请问如果是生物专业和化学专业的，就必须填"yes"吗？感觉生物和化学跟武器，核专
: 业，爆炸专业放在一起好奇怪的，不知道怎么填比较好。能否指点一下？非常感谢！万
: 谢！
o*1
20 楼
你们在哪？
【在 X******7 的大作中提到】
: 你这说的是个10几人的聚餐？可能理解失误，咳，有比无总是强了很多的。
【在 X******7 的大作中提到】
: 你这说的是个10几人的聚餐？可能理解失误，咳，有比无总是强了很多的。
a*2
21 楼
HTC EVO 要50一个月吗
【在 w****1 的大作中提到】
: 能换个好手机，每个月10块还是划得来的，少吃半顿buffet嘛。
: 再说，就算40一个月，还是很便宜啊。
【在 w****1 的大作中提到】
: 能换个好手机，每个月10块还是划得来的，少吃半顿buffet嘛。
: 再说，就算40一个月，还是很便宜啊。
T*t
22 楼
50ml基本上没法直接过gel filtration的柱子吧。体积太大了。
我觉得只能用差速离心吧。但是我自己从来没做过差速离心分蛋白，不知道能不能实现
lz的要求。
我觉得只能用差速离心吧。但是我自己从来没做过差速离心分蛋白，不知道能不能实现
lz的要求。
H*9
23 楼
应该是填No啊
X*7
24 楼
辛辛那提。
【在 o******1 的大作中提到】
: 你们在哪？
【在 o******1 的大作中提到】
: 你们在哪？
w*1
25 楼
应该是 evo epic 多10块
【在 a****2 的大作中提到】
: HTC EVO 要50一个月吗
【在 a****2 的大作中提到】
: HTC EVO 要50一个月吗
C*e
26 楼
我们有那个
一管只能装15ml
另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
我们平时用这个来concentrate purified protein
都需要离心很久很久
lysate的话不知道是不是很快就不行了
【在 r**o 的大作中提到】
: millipore ultrafree filter devices
: 60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
: 。。。
一管只能装15ml
另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
我们平时用这个来concentrate purified protein
都需要离心很久很久
lysate的话不知道是不是很快就不行了
【在 r**o 的大作中提到】
: millipore ultrafree filter devices
: 60ml 的体积。我手头有10K的，不确定有没有50k大小的。你可以察看他们的产品目录
: 。。。
c*u
27 楼
化学专业，填NO的，有没有没被check过的？
【在 H******9 的大作中提到】
: 应该是填No啊
【在 H******9 的大作中提到】
: 应该是填No啊
z*3
28 楼
re
s*n
29 楼
是不是用安猪的手机还要再多加10块？谢谢！
【在 w****1 的大作中提到】
: 不用担心，那个十块钱是跑不掉的。
【在 w****1 的大作中提到】
: 不用担心，那个十块钱是跑不掉的。
T*t
30 楼
嗯，我觉得够呛。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
s*u
31 楼
有一次被check,当时是因为当时我没带研究计划.
o*1
32 楼
nice city ...
【在 X******7 的大作中提到】
: 辛辛那提。
【在 X******7 的大作中提到】
: 辛辛那提。
s*y
33 楼
I remember seeing some 50mL membrane filtration units around.
They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
inside the tube.
For such setting, it won't be clogged by lysate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
inside the tube.
For such setting, it won't be clogged by lysate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们有那个
: 一管只能装15ml
: 另外就是lysate的话会不会很快就给堵上了
: 我们平时用这个来concentrate purified protein
: 都需要离心很久很久
: lysate的话不知道是不是很快就不行了
N*0
34 楼
我从来都填的yes, 第一次签学生时被check过,多年后签H1B倒直接过了. 个人觉得从问
题本身看应该填yes啊,如果签证官认为学化学/生物的就要被check,你这个问题填no也
没用啊.
题本身看应该填yes啊,如果签证官认为学化学/生物的就要被check,你这个问题填no也
没用啊.
s*y
35 楼
OK, it's call Millipore* Centriprep* Centrifugal Filter Units
They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
the
inserted
【在 s******y 的大作中提到】
: I remember seeing some 50mL membrane filtration units around.
: They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
: unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
: inside the tube.
: For such setting, it won't be clogged by lysate.
They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
the
inserted
【在 s******y 的大作中提到】
: I remember seeing some 50mL membrane filtration units around.
: They are inverted, that means the total solution is put in the bottom of the
: unit, and the filtrate will flow up to the reception unit that is inserted
: inside the tube.
: For such setting, it won't be clogged by lysate.
s*e
36 楼
I filed yes, and get checked for 4 weeks early this year
s*y
37 楼
Do you really have to seperate them by size?
Can you use ion exchange column first to seperate them by charge?
The ion exchange column will also concentrate your protein and make the
volume smaller.
Dialysis...I don't really like to do it because it will give you a bunch of
precipitation after overnight dialysis.
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
Can you use ion exchange column first to seperate them by charge?
The ion exchange column will also concentrate your protein and make the
volume smaller.
Dialysis...I don't really like to do it because it will give you a bunch of
precipitation after overnight dialysis.
【在 C*******e 的大作中提到】
: rt
: 想请教一下如果现在有细胞Lysate（破碎细胞以后9-10k rpm离心上清），
: 大量（50-100ml）
: 想按照蛋白大小快速粗分离
: 比如30kDa左右为分界
: 有没有什么好方法？
J*n
38 楼
这个可以填no？？？ 不算欺骗么
C*e
39 楼
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 s******y 的大作中提到】
: OK, it's call Millipore* Centriprep* Centrifugal Filter Units
: They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
:
: the
: inserted
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 s******y 的大作中提到】
: OK, it's call Millipore* Centriprep* Centrifugal Filter Units
: They have 30 kD cut off but can only hold 15mL sulotion.
:
: the
: inserted
s*3
40 楼
specialized skills or training
感觉这种像是问你是不是接受过 那种特别的战斗训练吧。。。
前面举得例子都是 firearm, explosive, unclear
感觉这种像是问你是不是接受过 那种特别的战斗训练吧。。。
前面举得例子都是 firearm, explosive, unclear
T*t
41 楼
用大一点的柱子或者两根柱子串起来不就好了。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
L*i
42 楼
当然是yes
现在check是常态了
现在check是常态了
s*r
43 楼
能不能用硫酸铵沉淀？
重做constructs显然要容易得多。
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
重做constructs显然要容易得多。
谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
我就是想知道有没有办法粗分一下
事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
纯化的时候GST绑在柱子上
得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
这个好像是个常见问题
好像有的可以通过额外连一段linker来解决
我就是想在不重新做construct的情况下
如果有办法可以一开始粗分一下，然后再上柱子，就方便多了
所以想的是有没有什么原始的生化方法可以粗分的
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
l*i
44 楼
H1B check 要多长时间啊？
C*e
45 楼
如果只有一个，做construct是容易
但我有十几个
而且就算加linker也不一定能保证这样的问题不会重现
如果有个简单的方法粗分，才是容易很多吧
毕竟条件什么都摸好了
【在 s******r 的大作中提到】
: 能不能用硫酸铵沉淀？
: 重做constructs显然要容易得多。
:
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
但我有十几个
而且就算加linker也不一定能保证这样的问题不会重现
如果有个简单的方法粗分，才是容易很多吧
毕竟条件什么都摸好了
【在 s******r 的大作中提到】
: 能不能用硫酸铵沉淀？
: 重做constructs显然要容易得多。
:
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
n*n
46 楼
4-5 weeks on average, some people are shorter (2 weeks) and some are longer
(6 weeks or more)
(6 weeks or more)
m*7
47 楼
Maybe you can filter your lysate using 0.22um filtration unit, or centrifuge
at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first.
at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first.
T*t
48 楼
50ml的lysate直接过0.22um的filter的话，绝对是会堵的。我那时是用syringe拿手压
的，连换了三个filter才算搞定，累了个半死。如果用vacuum可能会容易一点吧。
centrifuge
【在 m*********7 的大作中提到】
: Maybe you can filter your lysate using 0.22um filtration unit, or centrifuge
: at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first.
的，连换了三个filter才算搞定，累了个半死。如果用vacuum可能会容易一点吧。
centrifuge
【在 m*********7 的大作中提到】
: Maybe you can filter your lysate using 0.22um filtration unit, or centrifuge
: at high speed to get rid of precipitates/protein aggregates first.
s*y
49 楼
try to check if there is difference in PI value between your protein and the
GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
pulldown.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
pulldown.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
C*e
50 楼
谢谢
我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
因为我们用PreScission Protease
我想的是最好能提高resin的利用率
现在连在resin上的大多是GST tag alone
严重影响了纯化蛋白的产率
而后续研究又要用大量的蛋白
而且最好是同一batch提的
现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
the
seperate
【在 s******y 的大作中提到】
: try to check if there is difference in PI value between your protein and the
: GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
: the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
: pulldown.
我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
因为我们用PreScission Protease
我想的是最好能提高resin的利用率
现在连在resin上的大多是GST tag alone
严重影响了纯化蛋白的产率
而后续研究又要用大量的蛋白
而且最好是同一batch提的
现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
the
seperate
【在 s******y 的大作中提到】
: try to check if there is difference in PI value between your protein and the
: GST protein. If there is, then you can use ion exchange column to seperate
: the GST protein and your GST-fusion protein after the glutathione-resin
: pulldown.
s*y
51 楼
yeah, you can try to do a pilot test and see if your protein and the GST can
be differentially precipitated by different concentration of ammomiun
sulfate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
: 因为我们用PreScission Protease
: 我想的是最好能提高resin的利用率
: 现在连在resin上的大多是GST tag alone
: 严重影响了纯化蛋白的产率
: 而后续研究又要用大量的蛋白
: 而且最好是同一batch提的
: 现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
:
be differentially precipitated by different concentration of ammomiun
sulfate.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 我现在的问题不是elute以后怎么分开两个蛋白
: 因为我们用PreScission Protease
: 我想的是最好能提高resin的利用率
: 现在连在resin上的大多是GST tag alone
: 严重影响了纯化蛋白的产率
: 而后续研究又要用大量的蛋白
: 而且最好是同一batch提的
: 现在想到也许可行的是ammonium sulfate ppt
:
e*s
52 楼
你这种情况可以试试一个简单的办法
说不定Salt cut可以分出来。
按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
cut组分里。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
说不定Salt cut可以分出来。
按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
cut组分里。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢sunnyday，还特意去帮我查了产品
: 怎么说呢，这种centrifugal filter unit我很怀疑会很快就堵住了
: 尤其像lysate这种蛋白浓度很高的东西
: 我就是想知道有没有办法粗分一下
: 事实是这样的，GST-tag表达蛋白以后有一多半都是GST（25 kDa）
: 比较少的部分是GST-fusion protein （50 kDa）
: 纯化的时候GST绑在柱子上
: 得到的目的蛋白只有一点点（1 liter culture得到300 ul * 1 mg/ml）
: 这个好像是个常见问题
: 好像有的可以通过额外连一段linker来解决
C*e
53 楼
谢谢
可能会这么做
你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
【在 e****s 的大作中提到】
: 你这种情况可以试试一个简单的办法
: 说不定Salt cut可以分出来。
: 按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
: cut组分里。
可能会这么做
你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
【在 e****s 的大作中提到】
: 你这种情况可以试试一个简单的办法
: 说不定Salt cut可以分出来。
: 按照20%, 40%, 60%, 70%的浓度递增salt cut，很可能GST和融合蛋白在不同的Salt
: cut组分里。
l*s
54 楼
how about reusing GST resin?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 可能会这么做
: 你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢
: 可能会这么做
: 你说的salt cut就是NH4SO4 ppt吧
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