[合集] 问个基因克隆的事情 烦了快一年了# Biology - 生物学
d*r
1 楼
☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题