g*1
2 楼
在新实验室第一次做RT-PCR,用的是实验室传下来的protocol。
oligoT作RT以后再用cDNA扩增,使用200bp左右产物的primer sets扩增,3组全部扩出
产物;但是
同一个基因,1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照,知道PCR体系和
引物没问题。
但是试了很多次,包括使用其他基因的引物,都是括不出大片段。
这是什么情况?
oligoT作RT以后再用cDNA扩增,使用200bp左右产物的primer sets扩增,3组全部扩出
产物;但是
同一个基因,1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照,知道PCR体系和
引物没问题。
但是试了很多次,包括使用其他基因的引物,都是括不出大片段。
这是什么情况?
j*y
3 楼
难道不是每次都是一年吗? 为什么会第一年给两年半..
g*1
8 楼
更新:跑了个琼脂糖电泳,28S 和18S条带很清楚,有少量Smear。但是5S最亮,18S 看
起来比28S亮一点。这是不是跟降解有关?
起来比28S亮一点。这是不是跟降解有关?
g*1
10 楼
不知道非变形胶中是不是仍然适用2:1比例
s*y
11 楼
Well, you should add RNaseH. Because sometimes you never know what kind of
strange conformation those double-strand DNA-RNA can be.
They can easily inhibit your PCR reaction.
I would also suggest you to increase the template amount, and on the
meantime, try to do the RT-PCR again carefully.
【在 g******1 的大作中提到】
: 以前从不加RNAse,扩增2kb也没问题啊。
: 倒是确实不排除RNA降解的可能性
strange conformation those double-strand DNA-RNA can be.
They can easily inhibit your PCR reaction.
I would also suggest you to increase the template amount, and on the
meantime, try to do the RT-PCR again carefully.
【在 g******1 的大作中提到】
: 以前从不加RNAse,扩增2kb也没问题啊。
: 倒是确实不排除RNA降解的可能性
g*1
13 楼
多谢楼上建议,我重做一遍试试
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