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Questions about Protein Expression in E.coli

Questions about Protein Expression in E.coli# Biology - 生物学

h*g2011-03-12 08:03

1 楼

不过我用的是Eupho cafe 的方子，外观不是很好，比如空隙不是很均匀，因为没有面
粉筛，而且因为我用筷子检查是否烤
好，在中间弄除了一个洞（图片一）。不过尽管如此，口感很好，建议大家试一试，
一点都不复杂。我除了打发器以外，
没有任何特殊工具。比如，我没有食品秤，所以比例不是很严格，但是吃起来还是很不
错。同时想请教版上的高手，如果我
想给蛋糕裱花该如何打发鲜奶油（whipping cream), 因为我发现本来已经打发变硬的
奶油，过一会就很快变软变稀，从裱
花袋里出来就不成形了，是不是要加一些帮助凝固的东西。

h*12011-03-12 08:03

2 楼

往事如烟，随风而逝。不管曾经多么美好，都会随着时间慢慢腐朽。多大的难事现在看
来也不难，多大的伤心也不会伤心。爱恨情仇，都会随着时间的流逝而流逝。当年我们
曾经在一起，现在在见面也不过一笑而过。
高三那年，因为喜欢一个人而复读。本来可以不复读的，但是因为想和他在一起，去同
一所学校所以复读了。可惜复读的结果还未有第一次的好。越来越差，在复读也没有什
么意思了。所以，走吧，不复读了。最后的努力，也没有换来最后的在一起。你去了北
方，我来到了南方。你有了新的女朋友，而我只好祝福你们。
不曾后悔，当时的自己现在看看勇气可嘉。就算没有在一起，那时候很伤心，现在也没
那么难过了。没有考好很难过，现在想想就是小事一桩。你有了新女朋友，哭了一阵子
。但是，后来也好了。那些有关你的过去，就让他随风而逝。我想敬往事一杯酒，干了
这杯酒，就让所有的事情都过去。前尘往事，和你和我已经没有任何关系。我们各自安
好，过好现在还有以后得生活。以后不见面，不打扰，是最好的祝福，和最后给你的自
由还有温柔。

H*I2011-03-12 08:03

3 楼

“让他停下来！”女人兴奋起来，攀着车身钢架就翻上车顶，对着千夜大喊
大叫，同时用手里的突击步枪对着天空一通扫射。
千夜脸色一冷，不打算理会这些食腐鹫，他对女人的挑衅和示威视而不见，机车再
次加速，引擎顿时迸发出让人迷醉的声浪，疾向远方驶去。
沙蛇指挥着越野车一个急转弯，追了上去，同时拿出一把大口径狙击枪，瞄准千夜
的后背，一枪轰出。这是一把火药狙击枪，但是威力很大，若是一枪轰实了，普通战兵
都会立刻毙命。沙蛇就是奔着要千夜命来的！
千夜不打算惹麻烦，可不代表会容忍想杀自己的家伙。他一推车把，将功率加到极
致，机车立刻从温驯变成狂野，引擎轰鸣，整个机车震颤着划出一个大圈，溅起冲天尘
土，车头已经冲向疾驶过来的越野车。
千夜手上不知何时多出一支狙击枪，单手持枪，超长的枪管冰冷地对准了越野车，
枪身上的纹路迅速点亮。
车顶的女人眼力锐利，见识也很广，一看到千夜手中的枪，顿时亡魂大冒，尖叫道
：“鹰击！那是鹰击，掉头！快掉头！”
“不！冲过去，火力压制！”沙蛇吼着，越野车猛然加速，如脱缰野马般向千夜冲
去。
千夜端枪的右手稳若磐石，扣下扳机。
鹰击独特的声线响彻荒野，越野车整块挡风玻璃碎成了不计其数的晶莹细末，坐在
副驾驶位置上的沙蛇突然间就不见了脑袋，只留下一具端坐的无头尸体。
女人歇斯底里地尖叫起来，驾驶员也惊得下意识地猛打方向盘，越野车顿时在荒野
上失控般地转了好几圈。
鹰击再次轰鸣，越野车的引擎猛然爆炸，车中剩余的人全都被炸上天空，然后灼热
散飞的金属碎片掠过，象切奶油一样轻易切开了这些食腐鹫的躯体。
千夜依然稳稳地坐在机车上，单手持着鹰击，面色沉静，眼中连一丝波动都没有，
枪口缓缓抬起，指向其余两辆越野车。那两辆越野车猛地急转弯，疯狂加速，拼命逃去。
千夜没有兴趣去追杀他们，挥手把鹰击收回安度亚的神秘空间，就驾着机车一个大
回旋，继续向预定的方向驶去。
沙蛇犯了个致命的错误，他以为象鹰击这种威力的狙击枪，必须要有相应的射击姿
势。千夜只是单手持枪，如果敢就此扣下扳机，不光会伤到自己，也肯定射不中疾行中
的越野车。所以他才会下令加速冲过去，想要抢在对方下车瞄准前，拉近到攻击距离。
在沙蛇心目中使用鹰击的一定是狙击手，就算有的狙击手近战也很强，但怎么也不
可能超过他们这些在荒野上横行的食腐鹫，况且对方只有孤身一人。然而这世间总有意
外，沙蛇绝没有想到，鹰击对于千夜来说，早就是可以单手使用的武器。
千夜之所以还带着鹰击，是因为对这把武器极为熟悉，以他目前实力，不光可以单
手使用，而且能够连射十余枪，依然行有余力。对付不是很强的敌人，鹰击比五级狙击
枪更实用。
接下来的路途中，千夜还遇到了几拨黑暗种族的战士。相比之下，这些黑暗种族直
觉直觉敏锐得多，他们隐隐感觉到千夜身上透出的危险血气和来自位阶差异的威压，于
是都远远避开。
进入黑暗国度的边界，千夜下了机车，把这个大家伙也收入安度亚神秘世界，不大
的空间立时被塞得满满当当。
千夜换上便于行动的轻甲，取出双生花和深红之牙放在身上，就避开大路，在山间
行进，向地图上第一个黑暗种族的聚居点摸去。
根据情报，这个聚居点住着几十头蛛魔，仆蛛则有数百头。千夜在千米之外观察了
一会，确认了此处聚居点的情况，在地图上标注上蛛3的字样，就向下一处聚居地奔去。
下一个聚居地算是区域交通要地，因此规模颇大，各个黑暗种族都有，甚至还有魔
裔出没。这次千夜小心得多，登上了千米外的一座小山，依靠超凡视觉，在这个距离上
，他仍然能够看清聚居地的大概情况。
这里住着上千黑暗之民，可以称得上是个小镇了。观察之后，千夜在地图上标注了
混6的字样。
这是帝**方的通用标记方法，前面文字代表聚居地的主要种族，后面数字则是等级
。把黑暗种族城市依据规模，守卫力量，防御设施等划分多级，数字越大意味着城市越
强大。
比如暮光大陆上血族的大本营，就是高达20级的巨城。而黑暗议会的所在地，则无
从判断，因为至今还没有人类能够踏足那里。
就这样，千夜一路深入，一天一夜就前进上百公里，侦察了十余处聚居地。其中大
多是三级以下的微型据点，只有两个小镇，还有一座子爵城堡。
所有侦察过的地方，战力加起来已经相当于一个帝国主力师。但是这些兵力分散各
处，将来进攻时，只要行动足够迅速，就可以将其各个击破。四个子爵是麻烦，但在赵
雨樱出现后，千夜亦有了将他们分别击败的把握。
然而最终也是最大的障碍还是在于峡湾，若千夜想在那里建城，将会直接面对一位
蛛魔伯爵的怒火。峡湾距离那位伯爵的领地只有不到一百公里，几乎就相当于在他家门
口动土，战争几乎必然会爆发。
不过千夜仍然选择了这个地方，是因为周围数百公里的范围内，只有这头蛛魔伯爵
实力最弱。
他的位阶在伯爵中是最低一等，已经活了几百岁，以黑暗种族的寿命来说即将走到
生命尽头，实力正在逐渐下降，据说比勃拉姆斯也强不了多少。最重要的是，他的族群
中没有足够强力的继承者。
千夜准备一路潜到蛛魔伯爵的领地侦察完毕，再返回黑流城。以他此时战力，就是
遇到整编的黑暗种族巡逻队，也能直接吃下。不过千夜此行主要是取得和核实情报，因
此尽管身内精血早已消耗干净，他也忍住了诱惑，始终没有出手。
进入黑暗国度的第三天，千夜视线中已经出现恢宏优美的峡湾，碧色水面清澈如一
大块没有杂质的绿宝石，花岗岩山峰上是准备建城的高地。而越过峡湾，就是蛛魔伯爵
的领地了。
就在这时，千夜忽然心中一动，迅速跃上一株古树，收敛气息，将自己藏在树冠里。
很快远方就出现一个全速奔跑的狼人，方向正好对准千夜这边。
这头狼人已经变身，有一身偏黑色的油亮毛发，但身上处处是伤，后背上更有一道
长近一米，深可见骨的大创口，而且血肉翻卷，根本没有一丝自动愈合迹象。狼人那强
悍的身体再生能力好似失去了作用。
千夜的真实视野扫过，发现这头狼人的黑暗原力十分精纯，远胜普通狼人。在子爵
前就能够拥有如此精纯的黑暗原力，他显然是族群中天赋过人的天才。
这头狼人原本应有男爵实力，但此刻重伤之后，连奔跑都踉踉跄跄，恐怕连个骑士
都打不过。他直冲到千夜所在的大树下，突然一头栽倒，抽搐着一时爬不起来，身上所
有伤口全部迸裂，鲜血几乎是喷涌出来的。
远处林间，影影绰绰出现十余个身影，无声无息地走来。
千夜双眼微眯，这些人都是血族，而且个个实力不弱。为首者佩戴着三等子爵的绶
带，然而真实视野显示他的黑暗原力精纯程度不在重伤狼人之下，在千夜遇到过的血族
中，只有出自十二古老氏族的子爵才能够拥有这样的实力。
看来那个狼人就是被这些血族追杀。
千夜仍然收敛着气息，右手中已经多了两颗破魔秘银弹，悄无声息地压进双生花。
灌注了千夜血气的原力弹对血族是大杀器，用两颗破魔秘银弹其实有点浪费。若非出现
的血族数量众多，他连这两颗破魔秘银弹都想省了。
不过黑暗种族的内讧对千夜来说没有什么意义，只要不被卷入，他并没有出手的意
思。千夜做完临战准备，就继续看着树下的后续发展。
那个子爵缓步走向倒地不起的狼人，“你倒是挺能跑的，居然逃出了上千公里。不
过现在你再也跑不动了吧？席尔，听说你已经被群峰之巅吸纳，向来傲慢得很，连我们
十二氏族都不放在眼里。可是没想到会有这么一天吧？”
年轻狼人已经维持不住战斗形态，重新变回人形。他艰难地撑起身体，靠在古树树
干上，愤怒地盯着血族子爵，低沉地说：“就算你们在这里杀了我，可那件事还是迟早
会被外面的人知道。杜拉斯，你们瞒不了所有人！一旦事发，你们都要死！”
“那又怎么样？等我们的圣子得手，到时候连永夜议会都要对圣子高看一眼，谁还
会来多管闲事？”杜拉斯冷笑

c*v2011-03-12 08:03

4 楼

wdong,你知道有什么现成的拓扑分类图形的python库吗？
例如手写数字0,8的array图,最左下角那个点对这个图的winding number一定是0.
有现成这样一个函数f（a，S）计算a点对img array S
的winding number的吗？
以及高维data拓扑分类的库？

H*g2011-03-12 08:03

5 楼

Sorry I couldn't type in Chinese with lab computers.
I am trying to express my protein in E.coli these days. I tried with my
construct in E.coli BL21(DE3) with 1mM
IPTG at 37C for several time points, but couldn't observe any induction.
Does this mean there is no need for
me to try any lower temperature, such as 30C, 25C,etc, since even 37C has
no induction and they all won't
have any induction as well?
Thanks!

l*32011-03-12 08:03

6 楼

cong， MM做的很好吃的样子。。。

p*a2011-03-12 08:03

7 楼

骗字数到了这么令人发指的地步

w*g2011-03-12 08:03

8 楼

这个我不懂

【在 c*******v 的大作中提到】

: wdong,你知道有什么现成的拓扑分类图形的python库吗？
: 例如手写数字0,8的array图,最左下角那个点对这个图的winding number一定是0.
: 有现成这样一个函数f（a，S）计算a点对img array S
: 的winding number的吗？
: 以及高维data拓扑分类的库？

s*e2011-03-12 08:03

9 楼

You should try at least one lower temp, since sometimes it helps expression
for toxic protein.

d*e2011-03-12 08:03

10 楼

###此帖已应当事人要求删除###

T*t2011-03-12 08:03

11 楼

I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
say, 33C).
Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
strain BL21(DE3)pLysS.

h*g2011-03-12 08:03

12 楼

谢谢夸奖，不过我觉得是这个方子很强大，只要满足基本条件（准备齐材料，蛋白打发
合适，烤盘合适），你怎么做都不会
失败。我第一次做的时候用的是不沾的烤盘，而且也没加烤盘纸，所以蛋糕后来就塌了
，后来看了这个网站才知道因为不沾
的烤盘摩擦力太小的原因。我很懒，即使有秤都嫌麻烦，所以都是从网上查，一大勺糖
等于多少克，然后大概估计一下加多
少勺，而且我怕甜，一般都比方子上的量要少。
另外，网址在这里
http://www.euphocafe.com/recipe/recipe.asp?rid=240

【在 d**e 的大作中提到】

: ###此帖已应当事人要求删除###

g*r2011-03-12 08:03

13 楼

yes, try low IPTG conc. even down to 0.1 mM
and try room temp inducing and growing aftrwards

(

【在 T**********t 的大作中提到】

: I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
: say, 33C).
: Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
: strain BL21(DE3)pLysS.

l*32011-03-12 08:03

14 楼

哇。。。这个方子竟然有说多少克=多少勺或者杯，很方便了。
谢MM。。

【在 h*****g 的大作中提到】

: 谢谢夸奖，不过我觉得是这个方子很强大，只要满足基本条件（准备齐材料，蛋白打发
: 合适，烤盘合适），你怎么做都不会
: 失败。我第一次做的时候用的是不沾的烤盘，而且也没加烤盘纸，所以蛋糕后来就塌了
: ，后来看了这个网站才知道因为不沾
: 的烤盘摩擦力太小的原因。我很懒，即使有秤都嫌麻烦，所以都是从网上查，一大勺糖
: 等于多少克，然后大概估计一下加多
: 少勺，而且我怕甜，一般都比方子上的量要少。
: 另外，网址在这里
: http://www.euphocafe.com/recipe/recipe.asp?rid=240

n*w2011-03-12 08:03

15 楼

question 1: are you sure your sequence is right? ORF is not shifted?
question 2: are your product toxic to the cells? If they are, you need to
change an expression system.
question 3: is there any codon bias? If there is codon bias the expression
may be poor.
question 4: if the answer to Q1 is yes, to Q2 is no, to Q3 is no, then how
long is your induction? I have been expressing a fusion protein with Mw
116kD (including GST), I did a 4, 6, 8 hour time course and you should
ensure your induction time is enough.
question 5: if question 1-4 are not a problem to you, as they have suggested,
try lower temperature. I do all my expression under 22 degrees (I want to
try 18 degrees but my thermoshaker sucks...)
question 6: how do you determine if there is no induced expression? simply
by taking 20ul at each time points for SDS-PAGE or you centrifuge, sonicate,
etc?
Good luck.

h*g2011-03-12 08:03

16 楼

是呀，这个网站很不错的。

【在 l********3 的大作中提到】

: 哇。。。这个方子竟然有说多少克=多少勺或者杯，很方便了。
: 谢MM。。

I*a2011-03-12 08:03

17 楼

检查密码子，
有的要用codon plus的菌株表达

d*e2011-03-12 08:03

18 楼

###此帖已应当事人要求删除###

【在 h*****g 的大作中提到】

X*n2011-03-12 08:03

19 楼

Try 200 uM of IPTG at 16oC overnight.

c*62011-03-12 08:03

20 楼

s*e2011-03-12 08:03

21 楼

20C or even lower will be better -- 33C may not make big difference

(

【在 T**********t 的大作中提到】

: I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
: say, 33C).
: Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
: strain BL21(DE3)pLysS.

F*t2011-03-12 08:03

22 楼

赞啊
没有称也能bake
还做得那么好

H*g2011-03-12 08:03

23 楼

Thank you, guys!
I sequenced my expression plasmid and I am sure it is correct, no frame
shift, no mutations. I feel my protein
is not toxic to E.coli. I shaked the E.coli culture at 37C till OD600=0.6,
then add IPTG to 1mM. I also had a
second culture but not add IPTG.
I took 1.5mL every hour for 7 hours from both cultures (with and without IPTG), spin
down, sonicated, and loaded side-
by-side on SDS-PAGE, I couldn't see any band being induced.
I would try lower temperature and lower concentration of IPTG today.
Thank you guys!

k*u2011-03-12 08:03

24 楼

不用秤。。。
我自己开始尝试烘焙之前，还嘲笑我的美国朋友，measure everything。。。因为我们
中国炒菜
调料都是随性加的。。。
后来自己开始试着做蛋糕啥的了，恨不得把所有的度量工具全用上。。。哈哈哈
佩服不用秤做蛋糕的。。。太牛了。。。

【在 d**e 的大作中提到】

: ###此帖已应当事人要求删除###

p*u2011-03-12 08:03

25 楼

I know a friend who met similar problem (tried strain for codon bias, toxic
protein, none of them worked). He deleted about 10 amino acid at the N-
terminus of the protein, then the protein was expressed well in BL21 (DE3).

l*t2011-03-12 08:03

26 楼

看着就好吃

j*y2011-03-12 08:03

27 楼

跟风问一下，我现在也有同样的问题。DNA sequence没问题，也是BL21(DE3)细胞，可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（25）或者更低（17）incubate 过夜？

s*i2011-03-12 08:03

28 楼

看上去很松软，赞

T*t2011-03-12 08:03

29 楼

你有做positive control的plate么？如果pos control plate上也没有或者只有很少的
菌落，就很可能是transformation的温度或者时间出了问题。否则的话，有可能你
transform的时候用的质粒量太少，或者你的蛋白有毒性。

可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（
25）或者更低（17）incubate 过夜？

【在 j*****y 的大作中提到】

: 跟风问一下，我现在也有同样的问题。DNA sequence没问题，也是BL21(DE3)细胞，可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（25）或者更低（17）incubate 过夜？

n*w2011-03-12 08:03

30 楼

How do you do transformation?
using ligation product or the sequenced plasmid?
if you use sequenced plasmid and the concentration is around 200 ng/ul, you
simply can do a quick transformation (1ul DNA + 50ul competent cells (or
even 20ul), 20 minute on ice, 45 seconds 42 degree heat shock, 2 minute on
ice, then plate all of them).
and always set up controls.

可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（
25）或者更低（17）incubate 过夜？

【在 j*****y 的大作中提到】

j*y2011-03-12 08:03

31 楼

positive control plate 上有菌落的，我transform了50ng 的DNA，温度42,45sec，我
怀疑是蛋白有毒性。如果真的是有毒性，我能不能加大DNA的量？

【在 T**********t 的大作中提到】

: 你有做positive control的plate么？如果pos control plate上也没有或者只有很少的
: 菌落，就很可能是transformation的温度或者时间出了问题。否则的话，有可能你
: transform的时候用的质粒量太少，或者你的蛋白有毒性。
:
: 可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（
: 25）或者更低（17）incubate 过夜？

j*y2011-03-12 08:03

32 楼

是sequenced plasmid，我稀释了DNA到25ng/uL，然后transform了2uL到80ul的细胞里
，30min on ice，42 degree for 45 sec，plate all，没有菌落。。。

you

【在 n***w 的大作中提到】

: How do you do transformation?
: using ligation product or the sequenced plasmid?
: if you use sequenced plasmid and the concentration is around 200 ng/ul, you
: simply can do a quick transformation (1ul DNA + 50ul competent cells (or
: even 20ul), 20 minute on ice, 45 seconds 42 degree heat shock, 2 minute on
: ice, then plate all of them).
: and always set up controls.
:
: 可是transformation以后plate上没有菌落。这种情况应该怎么处理呢，是放在室温（
: 25）或者更低（17）incubate 过夜？

n*w2011-03-12 08:03

33 楼

What's the concentration of the plasmid?
I assume 25ng/ul is quite low for miniprep plasmid. And you just juse 50ng
DNA and 80ul bacteria (that's a lot for transformation). You know, heat
shock transformation efficiency is low and by doing so you make the
efficiency much lower...
I suggest you to try high concentration, let's say, 200ng/ul, and then mix
with 40ul competent cells, 30min on ice, 42 for 45s, 2min on ice and then
plate all. Let's see if there is any colony after the second try.
However, I cannot exclude the toxicity of your gene.

【在 j*****y 的大作中提到】

: 是sequenced plasmid，我稀释了DNA到25ng/uL，然后transform了2uL到80ul的细胞里
: ，30min on ice，42 degree for 45 sec，plate all，没有菌落。。。
:
: you

p*o2011-03-12 08:03

34 楼

先把所有的密码子换成E.coli的偏好密码子，重新合成基因片段
把IPTG从0.05mM起做浓度梯度，应该没有问题，我也有类似的经历后来就这样解决了

s*e2011-03-12 08:03

35 楼

Do u have a cleavable His-tag on you protein? Sometimes protein (esp
membrane protein) has a low yield which can not be found by comparing
induced and non-induced samples.
If your protein is really important for you, try add a Thrombin, TEV or SUMO
protease cutable His-tag and do a simple separation with Nikel beads. Then
check if there is difference between SDS-PAGEs with and without protease
incubation. Good luck.

IPTG), spin

【在 H*g 的大作中提到】

: Thank you, guys!
: I sequenced my expression plasmid and I am sure it is correct, no frame
: shift, no mutations. I feel my protein
: is not toxic to E.coli. I shaked the E.coli culture at 37C till OD600=0.6,
: then add IPTG to 1mM. I also had a
: second culture but not add IPTG.
: I took 1.5mL every hour for 7 hours from both cultures (with and without IPTG), spin
: down, sonicated, and loaded side-
: by-side on SDS-PAGE, I couldn't see any band being induced.
: I would try lower temperature and lower concentration of IPTG today.

e*s2011-03-12 08:03

36 楼

2个问题，
1）你检测的是Supernatant还是Total lysate?
2)你是依靠考染对比还是用的Western?
如果你上样的是total lysate，然后Western看不到明显的表达，那就不用试其他条件
了。
如果你只是SDS-PAGE后，用考染，很可能有表达，但灵敏度不够，建议WB对比。

frame
OD600=0.6,
without IPTG), spin

【在 H*g 的大作中提到】

H*g2011-03-12 08:03

37 楼

I used only supernatant this time. I also saved precipitate and haven't
tested
yet. I only ran supernatant with SDS-PAGE since I sincerely hope I could
observe a huge band somewhere, however, I didn't.
I used Invitrogen SimpleBlue (same as CommassieBlue) and haven't tried WB.
I will run SDS-PAGE precipitate as well (such as to add 50uL loading buffer,
boil and load 20 uL onto each lane).
Thanks a lot and let's go SUNNY!

【在 e****s 的大作中提到】

: 2个问题，
: 1）你检测的是Supernatant还是Total lysate?
: 2)你是依靠考染对比还是用的Western?
: 如果你上样的是total lysate，然后Western看不到明显的表达，那就不用试其他条件
: 了。
: 如果你只是SDS-PAGE后，用考染，很可能有表达，但灵敏度不够，建议WB对比。
:
: frame
: OD600=0.6,
: without IPTG), spin

H*g2011-03-12 08:03

38 楼

I do have plasmids that encode different truncated form of my protein.
I would try with those, thanks a lot!

toxic

【在 p**u 的大作中提到】

: I know a friend who met similar problem (tried strain for codon bias, toxic
: protein, none of them worked). He deleted about 10 amino acid at the N-
: terminus of the protein, then the protein was expressed well in BL21 (DE3).

n*w2011-03-12 08:03

39 楼

prepare samples from whole cell lysate, pre-sonication, post-sonication,
supernatant, pellet.

s*n2011-03-12 08:03

40 楼

Re this.
补充一点就是，如果你的蛋白有活性的话，你可以试试检测一下cell lysate的活性，
有时候蛋白表达了，但是表达量很少或者大部分形成inclusion body了，在SDS-PAGE
gel上根本看不出来。

n*w2011-03-12 08:03

41 楼

我现在就怀疑我的蛋白在inclusion body里面，有什么好办法解决吗？
谢谢。

【在 s********n 的大作中提到】

: Re this.
: 补充一点就是，如果你的蛋白有活性的话，你可以试试检测一下cell lysate的活性，
: 有时候蛋白表达了，但是表达量很少或者大部分形成inclusion body了，在SDS-PAGE
: gel上根本看不出来。

s*n2011-03-12 08:03

42 楼

你表达的蛋白有酶活性么，有的话测一下上清，没有的话只能做WB。如果确定上清里有
你的蛋白，而且你需要的量不大，你可以试试直接从上清纯化。如果要的量较大，可能
就需要摸条件了，比如温度，IPTG浓度，strain等，实在不行再试试refolding from
inclusion body.

【在 n***w 的大作中提到】

: 我现在就怀疑我的蛋白在inclusion body里面，有什么好办法解决吗？
: 谢谢。

H*g2011-03-12 08:03

43 楼

Do you mean whole lysate by just adding loading buffer (let's say 50uL to
precipitated E.coli from 1mL culture), boiling for 5min, and loading 15uL to
each lane on SDS-PAGE?

【在 n***w 的大作中提到】

: prepare samples from whole cell lysate, pre-sonication, post-sonication,
: supernatant, pellet.

s*f2011-03-12 08:03

44 楼

also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli.

s*f2011-03-12 08:03

45 楼

also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli.

s*f2011-03-12 08:03

46 楼

also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli.

e*s2011-03-12 08:03

47 楼

难道现在回帖都要高喊一声Sunny?! hehe
不知道别的地方，我们实验室做Expression test的标准程序是lysate和Sup都要检测，
用WB。特别要是用E.coli来表达真核蛋白，很难在考染里看到Overexpress的条带。
建议直接做WB，其实是省时间的。

buffer,

【在 H*g 的大作中提到】

: I used only supernatant this time. I also saved precipitate and haven't
: tested
: yet. I only ran supernatant with SDS-PAGE since I sincerely hope I could
: observe a huge band somewhere, however, I didn't.
: I used Invitrogen SimpleBlue (same as CommassieBlue) and haven't tried WB.
: I will run SDS-PAGE precipitate as well (such as to add 50uL loading buffer,
: boil and load 20 uL onto each lane).
: Thanks a lot and let's go SUNNY!