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Methylation实验中PCR的问题

Methylation实验中PCR的问题# Biology - 生物学

a*s2011-06-27 07:06

1 楼

车加满才15加仑
昨天加了半箱油，当时提示到室内取收据，有点急着回家，就直接走了
今天卡中出现了：EXXONMOBIL 101.00元
别人继续加了？
可以与信用卡公司dispute吗？
难道我加完油，别人还可以继续加？
===============
补充：
是Fideluty 新卡还不到10天啊
03/27/2011 EXXONMOBIL -- TEMP $101.00

x*s2011-06-27 07:06

2 楼

谢谢。

d*i2011-06-27 07:06

3 楼

我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
pyrsequencing检测甲基化程度。
问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
谢谢！

c*e2011-06-27 07:06

4 楼

啥卡?

【在 a********s 的大作中提到】

: 车加满才15加仑
: 昨天加了半箱油，当时提示到室内取收据，有点急着回家，就直接走了
: 今天卡中出现了：EXXONMOBIL 101.00元
: 别人继续加了？
: 可以与信用卡公司dispute吗？
: 难道我加完油，别人还可以继续加？
: ===============
: 补充：
: 是Fideluty 新卡还不到10天啊
: 03/27/2011 EXXONMOBIL -- TEMP $101.00

s*s2011-06-27 07:06

5 楼

首先引物设计对么？
模板要多用，要加DMSO,酶要好酶（Hifi Taq一类，最好加taq extender)，pcr
温度要低。当然这都做到了，有些还是批不出来，你最好多设计点引物，至少
有个阳性对照吧？

【在 d****i 的大作中提到】

: 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
: QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
: pyrsequencing检测甲基化程度。
: 问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
: 第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
: 第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
: 谢谢！

w*12011-06-27 07:06

6 楼

pending的还是post得？

【在 a********s 的大作中提到】

m*52011-06-27 07:06

7 楼

恩，用高特异性长引物配合GC buffer低退火温度+好酶
基本就不用摸条件了，由短到长战无不胜

a*s2011-06-27 07:06

8 楼

多谢楼上两位啊
补充：
卡是：Fidelity 新卡还不到10天啊
状态： 03/27/2011 EXXONMOBIL -- TEMP $101.00

d*i2011-06-27 07:06

9 楼

2批sample唯一的区别是sample不一样(但是treatment很类似)，其余的都一样。所以，
不可能是引物和PCR温度的问题。

HQ2011-06-27 07:06

10 楼

消费完了不要receipt就是跟自己过不去
后面当然可能有人加，甚至有可能被店主故意黑了

【在 a********s 的大作中提到】

j*x2011-06-27 07:06

11 楼

为什么用酚氯仿抽提DNA？这个纯度不太好吧

k*a2011-06-27 07:06

12 楼

pending 而已。等post了再说。

s*s2011-06-27 07:06

13 楼

没有啥肯定的。好P的东西怎么P都能做出来，不好P的东西同样条件，
稍微有点微小扰动就可能P出来。

【在 d****i 的大作中提到】

: 2批sample唯一的区别是sample不一样(但是treatment很类似)，其余的都一样。所以，
: 不可能是引物和PCR温度的问题。

a*s2011-06-27 07:06

14 楼

唉，可以与信用卡公司dispute吗？

【在 HQ 的大作中提到】

: 消费完了不要receipt就是跟自己过不去
: 后面当然可能有人加，甚至有可能被店主故意黑了

d*i2011-06-27 07:06

15 楼

为了得率高一些，sample很珍贵。

【在 j****x 的大作中提到】

: 为什么用酚氯仿抽提DNA？这个纯度不太好吧

h*s2011-06-27 07:06

16 楼

可以，不过信用卡公司很可能要你提供收据。

【在 a********s 的大作中提到】

: 唉，可以与信用卡公司dispute吗？

d*i2011-06-27 07:06

17 楼

大家都用哪个kit抽提DNA？
那个kit进行convert？我们现在用的是QIAGEN的，但是那个bisulfite mix每次都不能
彻底的溶解，tube下面总有一点颗粒的东西不能完全溶解，放60半小时也不行。

p*t2011-06-27 07:06

18 楼

新手不要瞎着急，这个很正常啊，是暂时的HOLDING，还没POST出来就不算，加油HOLD
101很正常。等过几天真正的数额出来了再说。

【在 a********s 的大作中提到】

s*s2011-06-27 07:06

19 楼

为啥这个得率高？苯酚这种东西抽不干净很麻烦的

【在 d****i 的大作中提到】

: 为了得率高一些，sample很珍贵。

HQ2011-06-27 07:06

20 楼

我觉得这个不正常
如果是50，100这种数字也就罢了
101这个数字，。。。

HOLD

【在 p****t 的大作中提到】

: 新手不要瞎着急，这个很正常啊，是暂时的HOLDING，还没POST出来就不算，加油HOLD
: 101很正常。等过几天真正的数额出来了再说。

m*y2011-06-27 07:06

21 楼

google "nested PCR"

【在 d****i 的大作中提到】

w*12011-06-27 07:06

22 楼

100%没事，楼主是自己吓唬自己。

【在 HQ 的大作中提到】

: 我觉得这个不正常
: 如果是50，100这种数字也就罢了
: 101这个数字，。。。
:
: HOLD

d*i2011-06-27 07:06

23 楼

谢谢！nested PCR我知道，我去看看用这个有没有办法改善。

【在 m*****y 的大作中提到】

: google "nested PCR"

l*g2011-06-27 07:06

24 楼

yes

【在 p****t 的大作中提到】

: 新手不要瞎着急，这个很正常啊，是暂时的HOLDING，还没POST出来就不算，加油HOLD
: 101很正常。等过几天真正的数额出来了再说。

HQ2011-06-27 07:06

25 楼

呵呵，我表示一定程度的怀疑
仅仅是PENDING当然是可能了
不过我确实知道加油不拿RECEIPT被坑的
被坑也就罢了，我还曾经听一个朋友说曾经发生过一个因为不拿RECEIPT导致最后成为是
一个犯罪行为的案件。也不知道是不是真的。

【在 w****1 的大作中提到】

: 100%没事，楼主是自己吓唬自己。

d*o2011-06-27 07:06

26 楼

FIDELITY AMEX加油的PENDING一向很高,而且数字颇有意思.
76油站的HOLD是$76.
EXXON是$101.
楼上表示怀疑的估计都是没它们家的卡吧...
正常情况.放心好了.

y*i2011-06-27 07:06

27 楼

really? I think it is the gas station that decides the hold amount.

【在 d****o 的大作中提到】

: FIDELITY AMEX加油的PENDING一向很高,而且数字颇有意思.
: 76油站的HOLD是$76.
: EXXON是$101.
: 楼上表示怀疑的估计都是没它们家的卡吧...
: 正常情况.放心好了.

d*o2011-06-27 07:06

28 楼

我不确定是谁定的HOLD AMOUNT.
但我其它的信用卡都没见过类似的HOLD AMOUNT.

【在 y****i 的大作中提到】

: really? I think it is the gas station that decides the hold amount.

o*y2011-06-27 07:06

29 楼

and Hess is $100.
I doubt they are using code to represent the gas station.

【在 d****o 的大作中提到】

: FIDELITY AMEX加油的PENDING一向很高,而且数字颇有意思.
: 76油站的HOLD是$76.
: EXXON是$101.
: 楼上表示怀疑的估计都是没它们家的卡吧...
: 正常情况.放心好了.

HQ2011-06-27 07:06

30 楼

呵呵，加油从来都是用油卡

【在 d****o 的大作中提到】

: FIDELITY AMEX加油的PENDING一向很高,而且数字颇有意思.
: 76油站的HOLD是$76.
: EXXON是$101.
: 楼上表示怀疑的估计都是没它们家的卡吧...
: 正常情况.放心好了.

B*g2011-06-27 07:06

31 楼

...
他们家一直这样
先pending几天就没了
dispute你也等账单出来啊
着急沙

【在 a********s 的大作中提到】

: 唉，可以与信用卡公司dispute吗？

f*c2011-06-27 07:06

32 楼

等post出来再看一般都不会有问题

c*l2011-06-27 07:06

33 楼

前面有个TEMP
应该只是pending的吧 post以后就对了
我的AMEX卡也是这样的

【在 a********s 的大作中提到】

: 多谢楼上两位啊
: 补充：
: 卡是：Fidelity 新卡还不到10天啊
: 状态： 03/27/2011 EXXONMOBIL -- TEMP $101.00

D*E2011-06-27 07:06

34 楼

恩，PENDING的就是这个数。

【在 w****1 的大作中提到】

: 100%没事，楼主是自己吓唬自己。

c*42011-06-27 07:06

35 楼

我第一次用加油也是10多的成了90多，打电话去说是石油公司故意多charge点钱试试那
张卡，让等到正式的就好了，然后过了几天从pending到正式的就是加钱的那个金额的
，应该没啥问题，小票收好就行了。

A*02011-06-27 07:06

36 楼

re

HOLD

【在 p****t 的大作中提到】

: 新手不要瞎着急，这个很正常啊，是暂时的HOLDING，还没POST出来就不算，加油HOLD
: 101很正常。等过几天真正的数额出来了再说。

s*c2011-06-27 07:06

37 楼

一般加油都要hold 100块钱左右的过几天就消失了不用着急

【在 a********s 的大作中提到】

C*n2011-06-27 07:06

38 楼

就是这样。等等就行了。我也出现过N次了