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请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？

请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？# Biology - 生物学

c*u2011-06-28 07:06

1 楼

在网上找不到啊

o*r2011-06-28 07:06

2 楼

在一个一百六七十人的小公司干了大约八个月。公司在八个月内只收到一个小订单，到
二月没钱支付员工工资了。2月14日，公司的核心技术卖给了另一个公司B。公司B收留
大约35人，其他人包括我（H1-B）被解雇了。一年后，公司B倒闭被另一公司C收购。
经过2个多月的时间，拿到2个当地的Offers。决定去一个大公司工作（工资涨了20%，
还有退休金，401K，PTO多了2个星期）。每年都涨工资，也拿到了绿卡。

a*u2011-06-28 07:06

3 楼

请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？

p*d2011-06-28 07:06

4 楼

https://elis.uscis.dhs.gov/
Next time, please google first b4 asking.

j*x2011-06-28 07:06

5 楼

Gene Synthesis,侃侃价

R*n2011-06-28 07:06

6 楼

从基因组DNA里面分段扩exon然后拼起来：）

S*e2011-06-28 07:06

7 楼

我是这样做的：从公司买的cDNA（这样可以保证质量），好像也不贵，
然后用pfu（pfu from invitrogen or NEB，记不清了，两家都用过），
扩了两个4kb,测序，然后拼接为8kb的片段。

c*r2011-06-28 07:06

8 楼

自己拼啊。
关键看你想干嘛。
如果想克隆出来慢慢玩儿，8kb，两段要是不行，分3段，4段怎么都可以了啊。不要用
random primer，用自己design几个primers也没多麻烦。顺利的话两个礼拜，不顺利一
两个月怎么也可以了。
如果需要很多samples拿来测序，一次扩也可以，但是要摸条件，RT需要调整protocol
，否则拿不到那么长的cDNA。慢慢试啦，不一定100%都可以成功，但是也不是不可能啦
。