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求教：作质谱前蛋白样品的处理
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求教：作质谱前蛋白样品的处理# Biology - 生物学
c*h
1 楼
【 以下文字转载自 Fashion 讨论区 】
发信人: lolita88 (lolita), 信区: Fashion
标 题: 【奔】绝对素颜～后面的照片心脏病慎入！准妈咪慎入～
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Feb 20 11:13:47 2010, 美东)
都26，7了，大妈啊！！！！
k我太懒了，周末如果在家就不洗脸，这楼是周末1天在家没有洗脸没有梳头穿着睡袍照
的，视频时抓拍的鬼脸照，绝对素颜。
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l*g
2 楼
教完这些基础，于苍梧很长时间内再也没出现过，直到第二年夏天清尘在河边舞动树枝
练枪的时候，于苍梧又出现了，他对清尘说：“习武是一件很吃苦又需要毅力的事情，
这一年来无人约束监督，你竟然自己坚持习练有所小成，浑金璞玉实在难得！
--------------人欲
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m*m
3 楼
接线松了？
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i*e
4 楼
为啥我收到的中文信经常显示成韩国字啊，还没地方选charset。
应该很多人碰到这个问题吧。没有解决办法？
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W*n
5 楼
最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？
谢谢!
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k*e
6 楼
这是lolita88 ?

【在 c********h 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 Fashion 讨论区 】
: 发信人: lolita88 (lolita), 信区: Fashion
: 标 题: 【奔】绝对素颜～后面的照片心脏病慎入！准妈咪慎入～
: 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Feb 20 11:13:47 2010, 美东)
: 都26，7了，大妈啊！！！！
: k我太懒了，周末如果在家就不洗脸，这楼是周末1天在家没有洗脸没有梳头穿着睡袍照
: 的，视频时抓拍的鬼脸照，绝对素颜。
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Y*u
7 楼
你自己在无人约束监督下能坚持吗？
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i*g
8 楼
你这个实验目前只能在酶切的时候做标记，然后用ITRAQ做定量分析。建议最好让做质
谱的实验室帮忙做。

【在 W*********n 的大作中提到】
: 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
: 制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
: 化蛋白的变化。
: 这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
: 我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
: 胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
: 请教做过的朋友：
: 1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
: 谱分析？
: 2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
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c*h
9 楼
他说是
你鉴定一下？

【在 k****e 的大作中提到】
: 这是lolita88 ?
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l*g
10 楼

我自己不咋样。

【在 Y**u 的大作中提到】
: 你自己在无人约束监督下能坚持吗？
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s*y
11 楼
裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。

最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
化蛋白的变化。
这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
请教做过的朋友：
1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
谱分析？
2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
去垢剂；请问这步操作会不会造成蛋白降解，尤其是磷酸化基团的去磷酸化？
2）质谱一般的上样量为多少？ 每个样品要多少ug, 才能够得到比较理想的检测结果？
20ug蛋白一般需要多少胰蛋白酶来降解？
3）大家一般会加入什么样的磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化？

【在 W*********n 的大作中提到】
: 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
: 制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
: 化蛋白的变化。
: 这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
: 我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
: 胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
: 请教做过的朋友：
: 1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
: 谱分析？
: 2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
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b*d
12 楼
罗师太，上了你的当啦，神游好恐怖呀，居然是鬼故事。俺一般只看神仙的故事的。。
。。
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W*n
13 楼
谢谢艳阳天！请问：
我是从小虫子里面分离小胃，不是细胞，洗一洗的作用是啥啊，更干净一些么？
名
想沉淀一下的目的，一来去掉裂解液中的去垢剂，二来浓缩一下蛋白，把样品全部上上
去（这个样品获取比较麻烦，而且解剖时间不能太长）。你说的裂解8M Urea，就是只
有8M Urea溶解在水中？（我得蛋白基础很薄弱）。而且裂解1mg的单层细胞组织需要多
少ul，什么条件下，多久可以彻底裂解？
你是否觉得沉淀蛋白的过程会对phosphotase 有影响？
我们跑质普的实验室一般对一个样品分跑三个泳道，每个泳道切成三份，再对每份进行
MS 分析，所以一个样品要做9个酶切，我做四个样品就要做36个酶切，酶切收费有点贵
，他说可以train我来做，节约开支。

【在 s******y 的大作中提到】
: 裂解的时候，先把细胞用dPBS洗一洗
: 既然你要跑总蛋白的胶，那何必用TCA沉淀呢？直接用8M Urea 裂解然后
: 直接上胶不更好么？这样还省得你操心phosphotase 的问题。
: 另外，如果你自己没有做过trpsin digestion, 不如让跑质谱的人帮你做算了。
: 他们一般都负责这一步的。你要自己做，万一没弄好还更麻烦。
:
: 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
: 制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
: 化蛋白的变化。
: 这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
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l*g
14 楼

那你千万别停，看完神游，看鬼股，然后你就不怕啥了。我的体验。

【在 b**d 的大作中提到】
: 罗师太，上了你的当啦，神游好恐怖呀，居然是鬼故事。俺一般只看神仙的故事的。。
: 。。
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s*y
15 楼
哦，这样的啊。
如果是培养的细胞的话，一般需要洗一洗来去掉培养基免得在分析样品的时候带进污染。
如果是在小虫里收集的胃。。。会不会有体液或者食物污染？如果有还是
要洗洗的。如果没有这个顾虑那就别洗了，听你讲起来好像样品很小的样子，
弄不好一洗就找不回来了。
如果裂解液里面的detergent过多，会干扰TCA沉淀的效果的。不过如果detergent
在１％以下还是可以用TCA的。TCA沉淀的时候蛋白都变性了，不会有phosphatase 作用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea　or guanidinium 的话，phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)来抑制phosphatase.
如果用8M Urea，一般都是8M Urea in PBS, pH 大致调一下不要超过９就好了。
1 mg 组织? 这么少？一般而言20倍体积8M Urea就够了，所以20ul 就够了，
短暂的超声一下(15~30sec)，然后vortex 一分钟应该就好了，最后再加1/4 的 5X SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel.
如果你们要做那么多trpsin digestion, 那还是自己做吧，找做质谱的人要一个
protocol 吧。我们学校这里做这个trpsin digestion的价格非常低，所以我一直都是偷懒让他们做的，自己都忘了怎么做了（惭愧一下）
如果你是第一次做这种实验，我建议你：
1。查查文献，看看别的实验室怎么做的。
2。先跑一个小样品（最好是一个正对照），确认自己做的样品能够在质谱里打出phosphorylated protein
3。最后叮嘱一点，注意处理样品的时候一定要带nitrile 手套，免得带入污染。

【在 W*********n 的大作中提到】
: 谢谢艳阳天！请问：
: 我是从小虫子里面分离小胃，不是细胞，洗一洗的作用是啥啊，更干净一些么？
: 名
: 想沉淀一下的目的，一来去掉裂解液中的去垢剂，二来浓缩一下蛋白，把样品全部上上
: 去（这个样品获取比较麻烦，而且解剖时间不能太长）。你说的裂解8M Urea，就是只
: 有8M Urea溶解在水中？（我得蛋白基础很薄弱）。而且裂解1mg的单层细胞组织需要多
: 少ul，什么条件下，多久可以彻底裂解？
: 你是否觉得沉淀蛋白的过程会对phosphotase 有影响？
: 我们跑质普的实验室一般对一个样品分跑三个泳道，每个泳道切成三份，再对每份进行
: MS 分析，所以一个样品要做9个酶切，我做四个样品就要做36个酶切，酶切收费有点贵
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n*a
16 楼
从小听都没听习惯呀？

【在 b**d 的大作中提到】
: 罗师太，上了你的当啦，神游好恐怖呀，居然是鬼故事。俺一般只看神仙的故事的。。
: 。。
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c*m
17 楼
没错,推荐broad institute

【在 i******g 的大作中提到】
: 你这个实验目前只能在酶切的时候做标记，然后用ITRAQ做定量分析。建议最好让做质
: 谱的实验室帮忙做。
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n*a
18 楼
看什么都没关系，一念佛就什么都不怕了。

。。

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 那你千万别停，看完神游，看鬼股，然后你就不怕啥了。我的体验。
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i*g
19 楼
你做这些事情，要和质谱实验室讨论了再做，不要想当然
这种是全细胞全组织的质谱分析，基本上属于stupid proteomics，
一个mudpit可以捞出3000个蛋白(但细胞里面含有恐怕10万种蛋白以上)，但phospho
proteomics很不好做，量要很多。
你还想做对比，很麻烦的。
他们大概可以用titium （？？）富集吸附一些phospho-peptide
根据我的记忆，有人发过nature 还是science（可能是这个journal），似乎是VEGF，
EGF+— 对整个细胞phospho assay, 用 SILAC, 非常类似你的实验设想。
时间大概是2005-2008年的论文，你去找找。
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l*g
20 楼

真的？我不行。
我念了几年佛了，就在读鬼谷前，我有时低头在镜子前的时候，不知咋的觉得后面有啥
，得回头看看。有点心虚。我想可能是镜子造成的光影啥的。读鬼谷后，现在就不拉。
不过不知道究竟是不是读鬼谷的效果。

【在 n*****a 的大作中提到】
: 看什么都没关系，一念佛就什么都不怕了。
:
: 。。
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K*S
21 楼
First of all, set up priority, do you want to measure changes in protein
expression or phosphorylationnchange. They are different workflows. For
initial screen, you don't need to do labeling.
1. Since you will run gel, it doesn't matter
2. It won't affect phosphorylation. I personally don't like it because you
will lose some small proteins. Lots of adaptor proteins in signaling
pathways are small.
3. On MS, you cannot load much (assuming lcmsms with capillary column).
Usually less than 1ug on column. Again, how much you start with depends on
your priority.
4. Sodium Vanadate is what everyone uses as phosphatase inihibitor

【在 W*********n 的大作中提到】
: 最近要做一个质谱实验，目的是检测一个信号转导通路上的蛋白被抑制剂抑制（没有抑
: 制的作为对照组），病原体感染后某个器官的蛋白水平变化, 当然很希望能够看到磷酸
: 化蛋白的变化。
: 这个器官是单层细胞的，几个平方毫米大小（取50个左右的个体作为一个样品）；
: 我的初步实验步骤是：器官细胞在裂解液中裂解---沉淀蛋白--凝胶电泳蛋白---胶上用
: 胰蛋白酶分解蛋白并收集--MS 分析。
: 请教做过的朋友：
: 1）用什么溶液和方法来进行器官细胞裂解能够充分裂解细胞，又能够不影响后面的质
: 谱分析？
: 2）在裂解完细胞后，用氯仿甲醇沉淀的方法纯化蛋白两次，并除去裂解液中一些盐和
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n*a
22 楼
"佛随念之所以归属于四护卫禅之一，乃是因为禅修者若能持续保持正念、忆念
佛陀的功德，除了可提升定力，也有保护的作用──当人们内心生起恐惧时，
可忆念佛陀的功德，那么内心的恐惧感会消失；又如当身心失衡时，忆念佛陀
的功德，便可以安忍身心的创痛；此外，修习佛随念时，非人众生将不敢伤害
我们，免除受到它们的干扰；遇到危险时可化险为夷，具有保护的威力。"

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 真的？我不行。
: 我念了几年佛了，就在读鬼谷前，我有时低头在镜子前的时候，不知咋的觉得后面有啥
: ，得回头看看。有点心虚。我想可能是镜子造成的光影啥的。读鬼谷后，现在就不拉。
: 不过不知道究竟是不是读鬼谷的效果。
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b*e
23 楼
Thanks

【在 K******S 的大作中提到】
: First of all, set up priority, do you want to measure changes in protein
: expression or phosphorylationnchange. They are different workflows. For
: initial screen, you don't need to do labeling.
: 1. Since you will run gel, it doesn't matter
: 2. It won't affect phosphorylation. I personally don't like it because you
: will lose some small proteins. Lots of adaptor proteins in signaling
: pathways are small.
: 3. On MS, you cannot load much (assuming lcmsms with capillary column).
: Usually less than 1ug on column. Again, how much you start with depends on
: your priority.
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l*g
24 楼

噢。我没有修习佛随念。不知道具体如何修。忆念佛陀的啥功德？
我自己有个打算，如果修的时候怕，就记住心本是清明而又无形无相的。
我想这样就不会怕幻象了。

【在 n*****a 的大作中提到】
: "佛随念之所以归属于四护卫禅之一，乃是因为禅修者若能持续保持正念、忆念
: 佛陀的功德，除了可提升定力，也有保护的作用──当人们内心生起恐惧时，
: 可忆念佛陀的功德，那么内心的恐惧感会消失；又如当身心失衡时，忆念佛陀
: 的功德，便可以安忍身心的创痛；此外，修习佛随念时，非人众生将不敢伤害
: 我们，免除受到它们的干扰；遇到危险时可化险为夷，具有保护的威力。"
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W*n
25 楼
非常感谢！

染。
用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea　or guanidinium 的话，
phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)
来抑制phosphatase.
SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel.

【在 s******y 的大作中提到】
: 哦，这样的啊。
: 如果是培养的细胞的话，一般需要洗一洗来去掉培养基免得在分析样品的时候带进污染。
: 如果是在小虫里收集的胃。。。会不会有体液或者食物污染？如果有还是
: 要洗洗的。如果没有这个顾虑那就别洗了，听你讲起来好像样品很小的样子，
: 弄不好一洗就找不回来了。
: 如果裂解液里面的detergent过多，会干扰TCA沉淀的效果的。不过如果detergent
: 在１％以下还是可以用TCA的。TCA沉淀的时候蛋白都变性了，不会有phosphatase 作用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea　or guanidinium 的话，phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)来抑制phosphatase.
: 如果用8M Urea，一般都是8M Urea in PBS, pH 大致调一下不要超过９就好了。
: 1 mg 组织? 这么少？一般而言20倍体积8M Urea就够了，所以20ul 就够了，
: 短暂的超声一下(15~30sec)，然后vortex 一分钟应该就好了，最后再加1/4 的 5X SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel.
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b*d
26 楼
还好，后来神仙出来啦。你觉得网上流行的那个门罗出体是不是就是那个阴神？俺觉得
蛮像的。

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 噢。我没有修习佛随念。不知道具体如何修。忆念佛陀的啥功德？
: 我自己有个打算，如果修的时候怕，就记住心本是清明而又无形无相的。
: 我想这样就不会怕幻象了。
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W*n
27 楼
和质朴那边的实验室交流过，好像就是普通的typsin 酶切, 可能是不同的方法？

【在 c******m 的大作中提到】
: 没错,推荐broad institute
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l*g
28 楼

其实的确是以神仙为主的。
人欲中我觉得有个地方很可笑，就是风君子如果真的是作者写的自己的话，小小股评，
非得写成是隐世神仙,第一高人。人真是都认为自己最行阿。 ：)
我没看过门罗出体。不知道是啥。

【在 b**d 的大作中提到】
: 还好，后来神仙出来啦。你觉得网上流行的那个门罗出体是不是就是那个阴神？俺觉得
: 蛮像的。
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W*n
29 楼
和他们讨论过，但是对于我具体的样品，我想通过高手们了解一下什么样的处理方法最
好；在着和老美交流感觉还是不是那么畅通--花钱那么多，希望做到万无一失。
我想先做一个蛋白的对比，当然如果有磷酸化蛋白的信息最好；
然后我再考虑下一步用Titium试剂盒富集磷酸化蛋白，然后再专门做一个磷酸化蛋白的
质谱（不过质朴室的工作人员说最新的富集试剂盒他们也用过，不太好用，还不如不富
集直接测，搞得我很郁闷：老板买了个富集试剂盒（听了推销商的甜言蜜语），兴冲冲
地想做出来东西）。
我会尽力去查查那篇文章。
谢谢！

【在 i*****g 的大作中提到】
: 你做这些事情，要和质谱实验室讨论了再做，不要想当然
: 这种是全细胞全组织的质谱分析，基本上属于stupid proteomics，
: 一个mudpit可以捞出3000个蛋白(但细胞里面含有恐怕10万种蛋白以上)，但phospho
: proteomics很不好做，量要很多。
: 你还想做对比，很麻烦的。
: 他们大概可以用titium （？？）富集吸附一些phospho-peptide
: 根据我的记忆，有人发过nature 还是science（可能是这个journal），似乎是VEGF，
: EGF+— 对整个细胞phospho assay, 用 SILAC, 非常类似你的实验设想。
: 时间大概是2005-2008年的论文，你去找找。
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b*d
30 楼
嗯，谢谢。
回你以前那个帖子，俺对俺当神仙充满了信心，到时候会记得回来找你的。。。。。。
不过你也蛮牛的啦，说不准比我先练成？话说回来，你到底是想成佛还是想成仙呀？
你现在想好啦吗？

【在 n*****a 的大作中提到】
: 看什么都没关系，一念佛就什么都不怕了。
:
: 。。
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W*n
31 楼
你才有才了，King of MS! 我这一阵子可能经常向你请教一下
my priority is change in protein at this experiment. The MS lab manager said
20ug protein can be loaded.
The I will try to use 8M Urea to do the lysis,and then altrosonic and boil
and then run the gel.
What should I do if my priority is phsophorylation change?
Thanks!

【在 K******S 的大作中提到】
: First of all, set up priority, do you want to measure changes in protein
: expression or phosphorylationnchange. They are different workflows. For
: initial screen, you don't need to do labeling.
: 1. Since you will run gel, it doesn't matter
: 2. It won't affect phosphorylation. I personally don't like it because you
: will lose some small proteins. Lots of adaptor proteins in signaling
: pathways are small.
: 3. On MS, you cannot load much (assuming lcmsms with capillary column).
: Usually less than 1ug on column. Again, how much you start with depends on
: your priority.
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b*d
32 楼
很好玩的。　俺就会。　跟那本书上写的差不多。　俺也对比过出体以后看见的境，和
现实中看见的实际物件的差别，的确是有的。不完全一样。　有点像梦，但感觉又不是
梦。

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 其实的确是以神仙为主的。
: 人欲中我觉得有个地方很可笑，就是风君子如果真的是作者写的自己的话，小小股评，
: 非得写成是隐世神仙,第一高人。人真是都认为自己最行阿。 ：)
: 我没看过门罗出体。不知道是啥。
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K*S
33 楼
for Urea buffer, don't boil it because it will cause carbamylation. Most ppl
use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling.
For phosphorylation, it depends on whether you are after pY or pS/pT.

said

【在 W*********n 的大作中提到】
: 你才有才了，King of MS! 我这一阵子可能经常向你请教一下
: my priority is change in protein at this experiment. The MS lab manager said
: 20ug protein can be loaded.
: The I will try to use 8M Urea to do the lysis,and then altrosonic and boil
: and then run the gel.
: What should I do if my priority is phsophorylation change?
: Thanks!
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b*d
34 楼
也不是的吧。得有两把刷子才行。可惜现实生活中，这种人几乎没有。

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 其实的确是以神仙为主的。
: 人欲中我觉得有个地方很可笑，就是风君子如果真的是作者写的自己的话，小小股评，
: 非得写成是隐世神仙,第一高人。人真是都认为自己最行阿。 ：)
: 我没看过门罗出体。不知道是啥。
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s*y
35 楼
Good point!!!!
Sorry I didn't think of this one

ppl

【在 K******S 的大作中提到】
: for Urea buffer, don't boil it because it will cause carbamylation. Most ppl
: use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling.
: For phosphorylation, it depends on whether you are after pY or pS/pT.
:
: said
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l*g
36 楼

噢。你还有这本事啊。
我也见过一些方法，就是不想练那个。

【在 b**d 的大作中提到】
: 很好玩的。　俺就会。　跟那本书上写的差不多。　俺也对比过出体以后看见的境，和
: 现实中看见的实际物件的差别，的确是有的。不完全一样。　有点像梦，但感觉又不是
: 梦。
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b*e
37 楼
MS不懂问MSKing，生物不懂问Sunny，：）
你digest Gel band之前都用IAA吗？这样的话cysteine 是不是多要加57？

ppl

【在 K******S 的大作中提到】
: for Urea buffer, don't boil it because it will cause carbamylation. Most ppl
: use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling.
: For phosphorylation, it depends on whether you are after pY or pS/pT.
:
: said
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l*g
38 楼

有没有刷子，反正自己第一。 ：）

【在 b**d 的大作中提到】
: 也不是的吧。得有两把刷子才行。可惜现实生活中，这种人几乎没有。
avatar
g*5
39 楼
marker,留爪
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H*9
40 楼
晕。人家徐胜治是做过大摩投资咨询公司地总经理兼首席证券分析师的哦，俗俗的看一
下，在世间混得怎么也比小小股评牛x很多倍吧...
小小提醒一下，你这里对 小小股评和隐世神仙 的论调，其实反映的跟那个金星火觉得
自己世间混得不错（question mark一下）就牛x的认为没几个人应该在他面前有资格炫
耀一样。。。
世间的地位和出世间的修行，根本就是apple to orange 。。。那你觉得，你偶像
waichi就是一个卖咸菜的，居然吹自己是解脱者，是不是你应该呕的

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 有没有刷子，反正自己第一。 ：）
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W*n
41 楼
几个问题：
1）" Most ppl use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling" ,这样做就不
会引起carbamylation之类的问题了吧？对质谱分析结果不会有影响了？
2）LCMSMS分析到底需要多少上样最好？ 听做质谱的老师讲不要超过25ug, 20ug左右应
该最好，几个ug就可以获取一些数据。请问1ug和20ug上样量作出的结果到底相差多大？
3）我的实验就想看看把一个信号传导比较上游的蛋白酶给抑制掉之后，看看下游的蛋
白及受其影响的蛋白的变化情况，在蛋白水平上看看一些效益蛋白的变化，在磷酸化水
平上看看受这个蛋白酶磷酸化调控的蛋白（这个蛋白磷酸化调控很多下游蛋白）的情况
。这样的蛋白应该是pY or pS/pT都有的吧？
4）我的样品是低等动物的单层细胞的肠，而且样品很少，你觉得什么方法处理最好，
是否8M Urea 最好？还有，这个质朴实验室用一种IEF buffer(7M Urea, 2M thiourea,
4%CHAPS), 是否这个也行？
谢谢！

ppl

【在 K******S 的大作中提到】
: for Urea buffer, don't boil it because it will cause carbamylation. Most ppl
: use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling.
: For phosphorylation, it depends on whether you are after pY or pS/pT.
:
: said
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l*g
42 楼

噢，看来小看他了。但是，我都不知道他，反正没那末有名吧。
j是认为自己清明。主要是他见的平凡高人太少。或者他根本没眼力识别。
我当时写那个帖子的时候，还真的想过waichi，总觉得他们哪里不一样。waichi世俗也
就是平平常常，可不像风君子那样卷入的事都很神，都是‘大事’。waichi是真实的平
常人。不需要‘大事’来现。

【在 H******9 的大作中提到】
: 晕。人家徐胜治是做过大摩投资咨询公司地总经理兼首席证券分析师的哦，俗俗的看一
: 下，在世间混得怎么也比小小股评牛x很多倍吧...
: 小小提醒一下，你这里对 小小股评和隐世神仙 的论调，其实反映的跟那个金星火觉得
: 自己世间混得不错（question mark一下）就牛x的认为没几个人应该在他面前有资格炫
: 耀一样。。。
: 世间的地位和出世间的修行，根本就是apple to orange 。。。那你觉得，你偶像
: waichi就是一个卖咸菜的，居然吹自己是解脱者，是不是你应该呕的
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b*u
43 楼
1）" Most ppl use 60-65 degree 20-30 minutes instead of boiling" ,这样做就不
会引起carbamylation之类的问题了吧？对质谱分析结果不会有影响了？
Use tris buffer to scavenge cyante ions if heating is necessary.
2）LCMSMS分析到底需要多少上样最好？ 听做质谱的老师讲不要超过25ug, 20ug左右应
该最好，几个ug就可以获取一些数据。请问1ug和20ug上样量作出的结果到底相差多大？
even 20 ug is overkilled for most proteomic labs with nano or cap lc setup.
for phosphoproteomics, you need more starting materials and enrichment will
take care of the loading capacity.
3）我的实验就想看看把一个信号传导比较上游的蛋白酶给抑制掉之后，看看下游的蛋
白及受其影响的蛋白的变化情况，在蛋白水平上看看一些效益蛋白的变化，在磷酸化水
平上看看受这个蛋白酶磷酸化调控的蛋白（这个蛋白磷酸化调控很多下游蛋白）的情况
。这样的蛋白应该是pY or pS/pT都有的吧？
most will be pS/T, given your small sample size, it will be really
challenging.
4）我的样品是低等动物的单层细胞的肠，而且样品很少，你觉得什么方法处理最好，
是否8M Urea 最好？还有，这个质朴实验室用一种IEF buffer(7M Urea, 2M thiourea,
4%CHAPS), 是否这个也行？
this is 2D-GEL buffer, not directly compatible with LC/MS. Shall be ok if
you run them on gel first.
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H*9
44 楼
中国前几名证券分析师你能说出几个名字阿...这人好像在某年是入评前十呢吧
晕，把waichi和小说中人物比，这都不能用妄心来描述了。。。用childish好不好吧
看小说吧，尤其是徐公子这样不重文比但是花精力讲道理和心得的小说，看里面的道理
就好了，情节和人物都是为了讲道理而安排的... 你没发现他的小说里花很多笔墨描写
人家心理活动，其实就是自己想说道理吗...

【在 l*****g 的大作中提到】
:
: 噢，看来小看他了。但是，我都不知道他，反正没那末有名吧。
: j是认为自己清明。主要是他见的平凡高人太少。或者他根本没眼力识别。
: 我当时写那个帖子的时候，还真的想过waichi，总觉得他们哪里不一样。waichi世俗也
: 就是平平常常，可不像风君子那样卷入的事都很神，都是‘大事’。waichi是真实的平
: 常人。不需要‘大事’来现。
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K*S
45 楼
blush..
I registered this ID long before I knew anything about mass spec.
Usually it's recommend to do reduction/alkylation to break disulfide bonds
and increase sequence coverage. Theoretically, all Cys should have +57 mass
shift.

【在 b******e 的大作中提到】
: MS不懂问MSKing，生物不懂问Sunny，：）
: 你digest Gel band之前都用IAA吗？这样的话cysteine 是不是多要加57？
:
: ppl
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l*g
46 楼

说老实话，我一个也不知道。我当年玩命研究股事的时候，看得都是英文，美股。基本
没有看过中国的。因为操作不方便。好吧。他挺能干。
我有一次偶然看见一个讲星座的，我那个星座还真是心里总是年少样。：）
我很喜欢看他讲道理。最喜欢看书里人遇事如何相对，会想自己又会如何，结果屡屡受
打击，比如，自己能那末大方吗？自己能不为所动吗？自己能做对的事吗？。。。。

【在 H******9 的大作中提到】
: 中国前几名证券分析师你能说出几个名字阿...这人好像在某年是入评前十呢吧
: 晕，把waichi和小说中人物比，这都不能用妄心来描述了。。。用childish好不好吧
: 看小说吧，尤其是徐公子这样不重文比但是花精力讲道理和心得的小说，看里面的道理
: 就好了，情节和人物都是为了讲道理而安排的... 你没发现他的小说里花很多笔墨描写
: 人家心理活动，其实就是自己想说道理吗...
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W*n
47 楼
please help me to have a look at the whole protocols and give some
suggesitons:
1) get 50midguts (about 3000cells/midgut, so about 1,500,000 cells or 80ug
protein totally),add 80ul lysis buffer (8M Urea, in 1XPBS, pH=8) including
Protease inhibitor and phosphatase, ultrasonic for 15-30 sec, then votex for
1 min. centrifuge for 10min at 14,000g and take the supernatant, add 16ul
5X loading buffer and heat for 20--30 min at 60 degree. load gel at 30ul/
lane and run for 2cm(for each sample, run three parellel bands). (Or could
you please offer me a standard protocol for Urea lysis used in your lab for
LCMSMS)
2) cut each bands into three equal part and put into 1.5ml Ep tube
separately, then do the trypsin digestion according to the protocol.
3) extract the peptide after digestion the following day according to the
protocol and it will be ready for LCMSMS analysis.
I will analysis four samples altogether: 6h ctl, 6h treatment, 24h ctl and
24h treatment. I would like to run one lane of 6h treatment sample for a
pilot experiment first. if we can get good result, then I prepare the four
samples.

染。
用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea　or guanidinium 的话，
phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)
来抑制phosphatase.
SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel.

【在 s******y 的大作中提到】
: 哦，这样的啊。
: 如果是培养的细胞的话，一般需要洗一洗来去掉培养基免得在分析样品的时候带进污染。
: 如果是在小虫里收集的胃。。。会不会有体液或者食物污染？如果有还是
: 要洗洗的。如果没有这个顾虑那就别洗了，听你讲起来好像样品很小的样子，
: 弄不好一洗就找不回来了。
: 如果裂解液里面的detergent过多，会干扰TCA沉淀的效果的。不过如果detergent
: 在１％以下还是可以用TCA的。TCA沉淀的时候蛋白都变性了，不会有phosphatase 作用。但是在裂解的时候，如果是用detergent而不是Urea　or guanidinium 的话，phosphatase 会是一个大顾虑。可以用Sodium Orthovanadate (Vanadate, Na 3 VO 4)来抑制phosphatase.
: 如果用8M Urea，一般都是8M Urea in PBS, pH 大致调一下不要超过９就好了。
: 1 mg 组织? 这么少？一般而言20倍体积8M Urea就够了，所以20ul 就够了，
: 短暂的超声一下(15~30sec)，然后vortex 一分钟应该就好了，最后再加1/4 的 5X SDS-buffer, boil for 10 minutes, then load on gel.
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n*a
48 楼

先谢谢你，能有个好老师指导那是再好不过啦。
没有想好呢。只能说最近看佛书多一些。还是觉得很多东西是共通的。
等到需要抉择的时候再说吧，现在想好以后也可能会变的。

【在 b**d 的大作中提到】
: 嗯，谢谢。
: 回你以前那个帖子，俺对俺当神仙充满了信心，到时候会记得回来找你的。。。。。。
: 不过你也蛮牛的啦，说不准比我先练成？话说回来，你到底是想成佛还是想成仙呀？
: 你现在想好啦吗？
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s*y
49 楼
你帖子里说的那个 IEF buffer (7M Urea, 2M thiourea,4%CHAPS) 更好。
那个其实就是8M Urea的改良版，适合于处理总蛋白加上膜蛋白。
20--30 min 加热时间太长了。我建议你在IEF buffer 里加
0.2M Tris-Cl,pH6.8, 然后75 oC 加热10~15 分钟。
其他处理倒是没有什么大问题

for
could
for

【在 W*********n 的大作中提到】
: please help me to have a look at the whole protocols and give some
: suggesitons:
: 1) get 50midguts (about 3000cells/midgut, so about 1,500,000 cells or 80ug
: protein totally),add 80ul lysis buffer (8M Urea, in 1XPBS, pH=8) including
: Protease inhibitor and phosphatase, ultrasonic for 15-30 sec, then votex for
: 1 min. centrifuge for 10min at 14,000g and take the supernatant, add 16ul
: 5X loading buffer and heat for 20--30 min at 60 degree. load gel at 30ul/
: lane and run for 2cm(for each sample, run three parellel bands). (Or could
: you please offer me a standard protocol for Urea lysis used in your lab for
: LCMSMS)
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K*S
50 楼
不熟悉midgut里的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ如何，也不知道你哪里的质谱实验室Ｓ
ＥＴＵＰ怎么样，如果是人的样品（血液，组织什么的），这样做出来的可能有５００
－６００个蛋白ＩＤ，估计都是含量最多的那些蛋白。
２ＣＭ的ＧＥＬ切３条带没有太大的意义。一般ＧＥＬ－ＢＡＳＥＤ的ＳＥＰＡＲＡＴ
ＩＯＮ都是１０－２０条带（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ或者ＩＥＦ）。ＬＩＱＵＩＤ　ＢＡＳ
ＥＤ的ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ　（ＳＣＸ,　ＲＰ-ＲＰ）什么的也都是１０到２０个Ｆ
ＲＡＣＴＩＯＮ。没有足够的ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ,质谱目前的ＤＹＮＡＭＩＣ　Ｒ
ＡＮＧＥ还是太小（相对于样品里的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ而言）

for
could
for

【在 W*********n 的大作中提到】
: please help me to have a look at the whole protocols and give some
: suggesitons:
: 1) get 50midguts (about 3000cells/midgut, so about 1,500,000 cells or 80ug
: protein totally),add 80ul lysis buffer (8M Urea, in 1XPBS, pH=8) including
: Protease inhibitor and phosphatase, ultrasonic for 15-30 sec, then votex for
: 1 min. centrifuge for 10min at 14,000g and take the supernatant, add 16ul
: 5X loading buffer and heat for 20--30 min at 60 degree. load gel at 30ul/
: lane and run for 2cm(for each sample, run three parellel bands). (Or could
: you please offer me a standard protocol for Urea lysis used in your lab for
: LCMSMS)
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W*n
51 楼
谢谢艳阳天！
和我们这边作质谱的老师交流，问他用什么样的裂解液最适合后面的LCMSMS分析，他说
“Since you’re running the samples on a gel before trypsin digest, don’t
worry about the buffers; use whatever you want. ” 然后我就把上面那封邮件发
给他，他回复“I don’t think urea is a good idea, since it will cause
problems for your gel (very difficult to totally remove). I would be
careful during your gel digest…make sure you do plenty of washes to remove
the protease inhibitors before the trypsin step. ”
我晕死了，他都说use whatever you want了，我找了大家认为很好的Urea方法，结果
他又说not a good idea. 我确实没有作这个的经验。邮件给他问他们试验室用什么样
的裂解液对于他们试验的仪器最好用，他也不反应。 觉得和他交流起来好累。。。
他说的cause problems for your gel (very difficult to totally remove). 是说
尿素也会跑进角里面去么？
本来觉得告诉他们我们样品的性质（就是个单层细胞的midgut），然后他们提供一个用
于他们实验室LCMSMS分析的最合适的试验方法，给我，我照着去做就行了。结果交流起
来这么麻烦，搞得我好疲惫。难道他们实验室的方法还是保密的？
Sunnyday能不能提供个其它的裂解方案，希望能够尽快裂解的，而且裂解的比较充分些
，因为我的样品太少。还有，能不能用裂解细胞后用于western blot的裂解液来裂解
midgut？
还有，你说的用超声波处理，就是那种有探头的超声波吧？
谢谢！

【在 s******y 的大作中提到】
: 你帖子里说的那个 IEF buffer (7M Urea, 2M thiourea,4%CHAPS) 更好。
: 那个其实就是8M Urea的改良版，适合于处理总蛋白加上膜蛋白。
: 20--30 min 加热时间太长了。我建议你在IEF buffer 里加
: 0.2M Tris-Cl,pH6.8, 然后75 oC 加热10~15 分钟。
: 其他处理倒是没有什么大问题
:
: for
: could
: for
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W*n
52 楼
且那么多条带，每个条带都要100多刀，这么说我的四个样品，12泳道，120条带，要最
少12000刀？是不是太贵了点？老板觉得4000刀已经很多了。
这样的话，因为我想获取信息的蛋白不太可能在膜上，能不能裂解细胞，只获取细胞内
的蛋白来做分析，而不去裂解细胞膜上的蛋白？
您所谓的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ是啥意思啊，我菜鸟水平，你就科普一些来给建
议，呵呵，谢谢啦！

【在 K******S 的大作中提到】
: 不熟悉midgut里的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ如何，也不知道你哪里的质谱实验室Ｓ
: ＥＴＵＰ怎么样，如果是人的样品（血液，组织什么的），这样做出来的可能有５００
: －６００个蛋白ＩＤ，估计都是含量最多的那些蛋白。
: ２ＣＭ的ＧＥＬ切３条带没有太大的意义。一般ＧＥＬ－ＢＡＳＥＤ的ＳＥＰＡＲＡＴ
: ＩＯＮ都是１０－２０条带（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ或者ＩＥＦ）。ＬＩＱＵＩＤ　ＢＡＳ
: ＥＤ的ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ　（ＳＣＸ,　ＲＰ-ＲＰ）什么的也都是１０到２０个Ｆ
: ＲＡＣＴＩＯＮ。没有足够的ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ,质谱目前的ＤＹＮＡＭＩＣ　Ｒ
: ＡＮＧＥ还是太小（相对于样品里的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ而言）
:
: for
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I*y
53 楼
你就是花12K做，一次做下来还不能保证成功获得有用的信息

【在 W*********n 的大作中提到】
: 且那么多条带，每个条带都要100多刀，这么说我的四个样品，12泳道，120条带，要最
: 少12000刀？是不是太贵了点？老板觉得4000刀已经很多了。
: 这样的话，因为我想获取信息的蛋白不太可能在膜上，能不能裂解细胞，只获取细胞内
: 的蛋白来做分析，而不去裂解细胞膜上的蛋白？
: 您所谓的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ是啥意思啊，我菜鸟水平，你就科普一些来给建
: 议，呵呵，谢谢啦！
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K*S
54 楼
简单的说，DYNAMIC RANGE就是说样品里浓度的差别。
拿SERUM来说吧，ALBU的浓度和IL-6浓度差10个数量级。LCMSMS有LOD和饱和的问题，一
般DYNAMIC RANGE是3-4个数量级，所以没有很强的前期的SEPARATION的话，你能检测到
得都是含量最高的那些蛋白。
如果是我的话，我一开始就做CELL LYSIS, IN SOLUTION DIGESTION, DESALTING, 然后
直接做LCMSMS （让他们RUN一个长的LC GRADIENT），一般也能出来几百个蛋白，先看
看你的样品里有什么东西，再设计下面的实验。这样你一开始是要付4个样品的钱。

【在 W*********n 的大作中提到】
: 且那么多条带，每个条带都要100多刀，这么说我的四个样品，12泳道，120条带，要最
: 少12000刀？是不是太贵了点？老板觉得4000刀已经很多了。
: 这样的话，因为我想获取信息的蛋白不太可能在膜上，能不能裂解细胞，只获取细胞内
: 的蛋白来做分析，而不去裂解细胞膜上的蛋白？
: 您所谓的ＤＹＮＡＭＩＣ　ＲＡＮＧＥ是啥意思啊，我菜鸟水平，你就科普一些来给建
: 议，呵呵，谢谢啦！
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K*S
55 楼
Urea肯定没问题，放心。
PROTEASE INHIBITOR是个GOOD POINT。现在好多LAB都不用大分子的PROTEASE
INHIBITOR（SOY BEAN提取出来的那几种），只用小分子的。因为大分子的PROTEASE
INHIBITOR确是会CARRY OVER到最后的DIGESTION，这已经是共识了。

remove

【在 W*********n 的大作中提到】
: 谢谢艳阳天！
: 和我们这边作质谱的老师交流，问他用什么样的裂解液最适合后面的LCMSMS分析，他说
: “Since you’re running the samples on a gel before trypsin digest, don’t
: worry about the buffers; use whatever you want. ” 然后我就把上面那封邮件发
: 给他，他回复“I don’t think urea is a good idea, since it will cause
: problems for your gel (very difficult to totally remove). I would be
: careful during your gel digest…make sure you do plenty of washes to remove
: the protease inhibitors before the trypsin step. ”
: 我晕死了，他都说use whatever you want了，我找了大家认为很好的Urea方法，结果
: 他又说not a good idea. 我确实没有作这个的经验。邮件给他问他们试验室用什么样
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