h*8
2 楼
在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用,难道切掉tag,
过个胶,不能分离吗?
请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐!
过个胶,不能分离吗?
请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐!
B*1
3 楼
It's a toy, albeit an expensive one.
j*x
4 楼
Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率
、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和
最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。
http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率
、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和
最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。
d*a
5 楼
我们家用的是bestbuy减价的时候买的,$139.
反正当时的老师说了"只要是大于等于76键的就行."
【在 A**n 的大作中提到】
: http://deals.woot.com/sellout
: 这个平时也就卖700-800。是不是这种便宜的不好给孩子用啊?
反正当时的老师说了"只要是大于等于76键的就行."
【在 A**n 的大作中提到】
: http://deals.woot.com/sellout
: 这个平时也就卖700-800。是不是这种便宜的不好给孩子用啊?
s*n
6 楼
以前参加GE training的时候问过很多Pharma的人,他们认为Ni leackage是最大问题。
a*g
7 楼
endostatin不是简单地一步Ni柱纯化,据我了解,应该是首先破菌,分离包涵体,充分
洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关
键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
【在 h**********8 的大作中提到】
: 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用,难道切掉tag,
: 过个胶,不能分离吗?
: 请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐!
洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关
键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能
以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding
成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常
impressive的。
我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
【在 h**********8 的大作中提到】
: 在老罗的贴子里看到关于恩度的问题。说是his tagged 蛋白不能药用,难道切掉tag,
: 过个胶,不能分离吗?
: 请大牛们解答:药用蛋白如何纯化?如果有相关书籍,还请推荐!
u*r
8 楼
药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题:
1.immunogenicity
这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的
immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy
studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
compromise the eeficacy?
2. 提存和处理过程中的杂质。
其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
refolding
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin不是简单地一步Ni柱纯化,据我了解,应该是首先破菌,分离包涵体,充分
: 洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关
: 键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
: bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能
: 以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding
: 成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常
: impressive的。
: 我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
1.immunogenicity
这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的
immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy
studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
compromise the eeficacy?
2. 提存和处理过程中的杂质。
其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
refolding
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin不是简单地一步Ni柱纯化,据我了解,应该是首先破菌,分离包涵体,充分
: 洗涤包涵体(洗涤过后纯度就达到90%),然后8M urea溶解,过Ni柱,然后有一步最关
: 键的refolding,也是罗的技术上最牛的地方。endostatin有一对跨越式disulfide
: bond,在体外条件下正确形成非常困难。这一步refolding后,50%以上的endostatin能
: 以可溶性单体存在,其他不能refold的则聚集形成胶体,经盐诱导沉淀后与refolding
: 成功的部分分离。最终产品的纯度超过99%,银染无杂带。整个工艺应该还是非常
: impressive的。
: 我也不知道前面为什么有人说his tag非得切掉。
a*g
9 楼
endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99%
的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然
不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题:
: 1.immunogenicity
: 这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的
: immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy
: studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
: compromise the eeficacy?
: 2. 提存和处理过程中的杂质。
: 其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
: 其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
:
的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。
罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然
不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。
如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 药用蛋白在纯度之外还要要考虑几个重要的问题:
: 1.immunogenicity
: 这也就是要切去his的原因,虽然his的免疫原性不高,但是还是有的。这所产生的
: immunogenicty不仅使其可能对人体有害,还会complicate the whole efficacy
: studies. Is the efficacy coming from the immunogenicity or may be it
: compromise the eeficacy?
: 2. 提存和处理过程中的杂质。
: 其中包括内毒素,各种病原体等。前面楼提到的ni-leakage也是其中。
: 其工艺据你的描述也没有什么了不起的。
:
u*r
12 楼
我没有trivialize。
遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白
都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。
99%
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99%
: 的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。
: 罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然
: 不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。
: 如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白
都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。
99%
【在 a******g 的大作中提到】
: endostatin的refolding是一件极其困难的事情,Folkman最早的paper里他们提到有99%
: 的蛋白沉淀而无法复性,所以罗的工艺在此处有独到之处。
: 罗的工艺基本是遵循纯化,复性,再纯化(不依赖Ni柱)的途径,最后产品纯度高当然
: 不只是蛋白质,并且元素检验也没有Ni残留,至于你说的endotoxin更是检测不出。
: 如果你不了解具体的过程,就不要着急trivialize别人的东西。
a*g
13 楼
第一步从包涵体中纯化是用Ni柱,第一步结束之后需要透析到酸性环境下除去所有尿素
且确保不沉淀,然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对,然后有一个再纯化的
过程去除没有复性而聚集的蛋白,这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC,走gel
filtration,结果都非常好。
在实验室里,罗从来不会公布复性的方法,因为这个是商业机密,没有哪个学生知道。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 我没有trivialize。
: 遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白
: 都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
: 是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。
:
: 99%
且确保不沉淀,然后在一个特定配方内进行复性和S-S正确配对,然后有一个再纯化的
过程去除没有复性而聚集的蛋白,这一步不用Ni柱。最终产物走HPLC,走gel
filtration,结果都非常好。
在实验室里,罗从来不会公布复性的方法,因为这个是商业机密,没有哪个学生知道。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 我没有trivialize。
: 遇到过一个在他实验室中干过的兄弟,提到其提纯还是运用了Ni柱。此外,所有的蛋白
: 都是从inclusion body中来,当然在crude solution中就比cytosol中的得到的高。但
: 是最终产物时常有aggregate,但就是遮着掩着。
:
: 99%
s*n
17 楼
这个endostatin不能用insect or CHO cell表达吗?
a*g
21 楼
也许后来有学生去做复性,那个我并不了解,所以也不好说。
临床数据没有保密,06年罗来Children's hospital Boston做报告,展示了不少三期临
床的数据。一期二期的结果我也都看到过,这个不是保密的。
当然了,效果确实比较modest,并且作用机理不明,其免疫原性是否起作用也不是十分
清楚,并且不能单独用药,需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线
化疗药联合用。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 其学生有去公司中做的。
: 国内特色之一。
: 相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西,但是,这是吗?如果真是大牛东西,为什
: 么这一在美国当年轰动一是的药物,没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数
: 据,罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
临床数据没有保密,06年罗来Children's hospital Boston做报告,展示了不少三期临
床的数据。一期二期的结果我也都看到过,这个不是保密的。
当然了,效果确实比较modest,并且作用机理不明,其免疫原性是否起作用也不是十分
清楚,并且不能单独用药,需要与taxol联合用。但是所有的蛋白类抗癌药都得和一线
化疗药联合用。
【在 u*******r 的大作中提到】
: 其学生有去公司中做的。
: 国内特色之一。
: 相信在国外的TZ都想国内多做原创性的东西,但是,这是吗?如果真是大牛东西,为什
: 么这一在美国当年轰动一是的药物,没有人从国内购买。据说当时国外公司要看临床数
: 据,罗也说是商业机密不给看。是不是什么都可用商业机密一叶遮目。
h*8
34 楼
太感谢啦!!!
【在 j****x 的大作中提到】
: Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
: http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
: 切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率
: 、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和
: 最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。
【在 j****x 的大作中提到】
: Therapeutic Proteins : Methods and Protocols
: http://www.springerprotocols.com/BookToc/doi/10.1385/1592599222
: 切掉His-taq再纯化理论上当然没问题,但是存在不少不确定因素:folding、酶切效率
: 、得率等,当然最最重要的是成本。对罗某某而言,最重要的显然是以最简单的步骤和
: 最低的成本包装上市,其他的对他而言无足轻重了。
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