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请教：怎样correct质粒中的一个点突变呢

请教：怎样correct质粒中的一个点突变呢# Biology - 生物学

k*y2012-04-19 07:04

1 楼

中秋晚上做的，一直忙娃，现在才有空发。新手新作，请版上大牛们不吝赐教哈
第一次做月饼，冰皮的相对广式的来说简单一些，而且上次问了碱水的问题，没有很好
解决，熬糖浆也太麻烦，所以先从冰皮的下手了，呵呵！~
用的是赫赫有名君之的方子，纯属抄袭，如有雷同，纯属意料。。。
做红豆沙很简单，浸泡一晚，然后大火烧开，小火熬至出沙，用大汤勺把红豆碾成红豆
沙，加糖，加一小块黄油提香。红豆沙没有过滤去皮，一是觉得麻烦，二是家人觉得有
皮的红豆沙口感也很好，有赤豆棒冰的感觉：）
冰皮月饼的制作完全copy君之的方子，没有做任何改变
http://blog.sina.com.cn/s/blog_4a5089ff0100adyk.html
做出来的冰皮很黏，用了很多的熟糯米粉才勉强搞定，个人觉得是因为第3步的稀面糊
没有蒸熟。按照方子，用电蒸锅蒸了20分钟，结果搅拌的时候四周已经是黏黏的固体，
中间却还是流动状态，但为了试试跟方子一样的步骤，所以就没有继续蒸。做月饼的时
候黏黏的很难成型，放入冰箱冷藏一会儿后，还是很黏，个人感觉其他步骤不会出错，
只有面糊没有蒸熟的原因了。
虽然成型困难，做出的饼皮也软塌塌的一摁就变形，拿起来得小心翼翼，但是口感相当
不错，像高中时候经常吃的糯米糍冰激凌，猪头老公非常喜欢，小猪宝太小，没有口福
，哇咔咔~~
废话太多了，上图！！

c*d2012-04-19 07:04

2 楼

测序以后发现一个点突变
如果不想重新做构建的话
有什么办法可以correct it？
谢谢啦

F*t2012-04-19 07:04

3 楼

有

k*l2012-04-19 07:04

4 楼

Site-directed mutagenesis
or cut that piece out, PCR that piece from a right plasmid,do a ligation

【在 c****d 的大作中提到】

: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦

F*t2012-04-19 07:04

5 楼

明年的这个时候娃就可以吃一点点了

N22012-04-19 07:04

6 楼

1)screen 3-5 more colonies and verify the sequence of that site by
sequencing.
2)if there is no correct one, it seems the fragment used for ligation having
that mutation.
3) do a reverse PCR to fix it if you plasmid is not too big.
4)site mutegensis by Quick Change
5)rebuild the plasmid with new fragments from PCR using Phusion DNA
ploymerase
from 3) to 5) find any one which will be easy for you.
good luck!

【在 c****d 的大作中提到】

: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦

k*y2012-04-19 07:04

7 楼

好快，呵呵，谢谢哈，包子好吃！
恩，小家伙肯定也爱吃，呵呵~~

【在 F*******t 的大作中提到】

: 明年的这个时候娃就可以吃一点点了

c*d2012-04-19 07:04

8 楼

谢谢了
不过第二点是不是和我重新做这个质粒差不多麻烦了

【在 k****l 的大作中提到】

: Site-directed mutagenesis
: or cut that piece out, PCR that piece from a right plasmid,do a ligation

b*t2012-04-19 07:04

9 楼

mm下次可以试试毛毛妈的方子，不沾很多，另外实在很粘的话可以全程隔着保鲜膜操作
，就不会沾到手上了

【在 k*******y 的大作中提到】

: 中秋晚上做的，一直忙娃，现在才有空发。新手新作，请版上大牛们不吝赐教哈
: 第一次做月饼，冰皮的相对广式的来说简单一些，而且上次问了碱水的问题，没有很好
: 解决，熬糖浆也太麻烦，所以先从冰皮的下手了，呵呵！~
: 用的是赫赫有名君之的方子，纯属抄袭，如有雷同，纯属意料。。。
: 做红豆沙很简单，浸泡一晚，然后大火烧开，小火熬至出沙，用大汤勺把红豆碾成红豆
: 沙，加糖，加一小块黄油提香。红豆沙没有过滤去皮，一是觉得麻烦，二是家人觉得有
: 皮的红豆沙口感也很好，有赤豆棒冰的感觉：）
: 冰皮月饼的制作完全copy君之的方子，没有做任何改变
: http://blog.sina.com.cn/s/blog_4a5089ff0100adyk.html
: 做出来的冰皮很黏，用了很多的熟糯米粉才勉强搞定，个人觉得是因为第3步的稀面糊

c*d2012-04-19 07:04

10 楼

多谢！
刚刚送了剩下的几个clone去测序但愿有个好的
但是原始的template应该没问题那个质粒是测过序的
somehow应该就是pcr过程中mutate了
我分子生物学做的不是很多不知道reverse PCR是咋个意思
这个plasmid有10k以上算是大的吗？
site mutegenesis 一般自己能做吗还是送出去公司做呢

having

【在 N2 的大作中提到】

: 1)screen 3-5 more colonies and verify the sequence of that site by
: sequencing.
: 2)if there is no correct one, it seems the fragment used for ligation having
: that mutation.
: 3) do a reverse PCR to fix it if you plasmid is not too big.
: 4)site mutegensis by Quick Change
: 5)rebuild the plasmid with new fragments from PCR using Phusion DNA
: ploymerase
: from 3) to 5) find any one which will be easy for you.
: good luck!

i*o2012-04-19 07:04

11 楼

我想吃啊！！！！！！！！！！！！

【在 k*******y 的大作中提到】

b*s2012-04-19 07:04

12 楼

做cloning，我觉得要是有问题，干脆重做。要是只是插入片段上有突变，重新扩增，
酶切，ligation也不算麻烦。一时偷懒，下面的步骤可能麻烦会更多，经常到最后还要
重新来过。

【在 c****d 的大作中提到】

: 谢谢了
: 不过第二点是不是和我重新做这个质粒差不多麻烦了

B*e2012-04-19 07:04

13 楼

好看!!

【在 k*******y 的大作中提到】

l*g2012-04-19 07:04

14 楼

克隆牛人教我的是：如果pcr的片段比较大(突变几率比较高的话），那么一开始就set
up几个pcr，然后独立做克隆，一起送去测序，然后有突变的话，运气好的时候另一个
pcr出来的片段那那一块没突变，那么可以切下来subcloning过去替换。
一开始设几个独立的pcr，是为了防止pcr刚开始几个cycle就出现mutation，那么出来
的产物就几乎全部有mutation。
如果片段不大的话，重新来过啦～

c*22012-04-19 07:04

15 楼

漂亮！

g*52012-04-19 07:04

16 楼

来米国后发现不会作克隆了。。。
以前国内没有克隆不出来的载体
现在怎么也作不好。
大家讨论下，关键技术点是什么？

k*y2012-04-19 07:04

17 楼

好的，下次试试看毛毛妈的！谢谢！
隔着保鲜膜操作的话，与保鲜膜分离也很有难度吧？

【在 b*******t 的大作中提到】

: mm下次可以试试毛毛妈的方子，不沾很多，另外实在很粘的话可以全程隔着保鲜膜操作
: ，就不会沾到手上了

r*y2012-04-19 07:04

18 楼

easiest way is to do site mutagenesis to get it back to the correct one.

k*y2012-04-19 07:04

19 楼

呵呵，mm来，我做给你吃！

【在 i******o 的大作中提到】

: 我想吃啊！！！！！！！！！！！！

c*d2012-04-19 07:04

20 楼

我觉得这个很有道理啊
比如我现在的多个clone 是一个pcr出来的
结果测序回来没有一个好的
但是mutation有同一位置的也有不同位置的
我这个可能就是因为片段太大了

set

【在 l******g 的大作中提到】

: 克隆牛人教我的是：如果pcr的片段比较大(突变几率比较高的话），那么一开始就set
: up几个pcr，然后独立做克隆，一起送去测序，然后有突变的话，运气好的时候另一个
: pcr出来的片段那那一块没突变，那么可以切下来subcloning过去替换。
: 一开始设几个独立的pcr，是为了防止pcr刚开始几个cycle就出现mutation，那么出来
: 的产物就几乎全部有mutation。
: 如果片段不大的话，重新来过啦～

k*y2012-04-19 07:04

21 楼

呵呵，谢谢！

【在 B********e 的大作中提到】

:
: 好看!!

c*d2012-04-19 07:04

22 楼

是这样
从质粒1里边扩增片段A
从质粒2里边扩增片段B
然后把A和B连起来再接到vector里边
其中片段A还比较大
现在就一个mutation 所以我想如果有简单办法correct的话
就不用重新来一遍了

【在 b******s 的大作中提到】

: 做cloning，我觉得要是有问题，干脆重做。要是只是插入片段上有突变，重新扩增，
: 酶切，ligation也不算麻烦。一时偷懒，下面的步骤可能麻烦会更多，经常到最后还要
: 重新来过。

k*y2012-04-19 07:04

23 楼

呵呵，谢谢！

【在 c********2 的大作中提到】

: 漂亮！

l*g2012-04-19 07:04

24 楼

这个mutation的上下游有酶切位点吗？如果有的话，从原来质粒里直接切了替换过去。
site mutagenesis也是个办法，但毕竟也是pcr，不排除mutation的可能，而且连
vector的部分也要sequence。

【在 c****d 的大作中提到】

: 是这样
: 从质粒1里边扩增片段A
: 从质粒2里边扩增片段B
: 然后把A和B连起来再接到vector里边
: 其中片段A还比较大
: 现在就一个mutation 所以我想如果有简单办法correct的话
: 就不用重新来一遍了

l*z2012-04-19 07:04

25 楼

真好看！一定也很好吃

w*22012-04-19 07:04

26 楼

直接在突变位点设计引物overlapping. 用保真酶pcr, DapI 消化PCR产物，转化，挑
克隆测序。

【在 c****d 的大作中提到】

: 测序以后发现一个点突变
: 如果不想重新做构建的话
: 有什么办法可以correct it？
: 谢谢啦