最近做一个克隆subcloning很郁闷！# Biology - 生物学
S*6
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Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是有没有方法解决这个问题？希
望能尽快得到插入全长的克隆。多谢！
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是有没有方法解决这个问题？希
望能尽快得到插入全长的克隆。多谢！
