求助:如何溶膜蛋白(WB of dopamine receptor)# Biology - 生物学
b*n
1 楼
请问版上有玩GPCR尤其是dopamine receptor的兄弟姐妹不
我现在在做DR internalization, 试了好几种办法,
不管是Membrane biotinylation,
或者是用Flag M2在没有fix之前去label外膜上的receptor
或者是用Radio ligand来做,
都不是很成功,最近试了一下用Sucrose gradient (35%)来分heavy membrane 和light
vesicle, 应该是有看到了一些internalization.
不过最大的问题是用FLAG M2做完WB后看到的并不是一条单一的带,而是一片
的smear,
应该是某些地方没做好,所以D2R都聚集了
用的是Biorad的SDS loading dye 配方直接溶解膜
或者也试过RIPA和TBS+10%甘油+1%triton
效果都不是太好
但是看了不少paper貌似人家都是做得出来了
这个事情搞了大半年,一直没能搞定,老板又特别楞,从来不给些建设性的意见,每隔
一段时间都要威胁一下做不出来就开除,已经被威胁了十数次,真是有点窘境穷途了,,
,,还能不能接着玩生物就在此一举了
版上卧虎藏龙,人才辈出,有没有玩7TM receptor玩得比较遛的达人给些建议,拉小弟
一把
感激不尽,感激不尽
图做得实在优点丑,惭愧了, 图上的是dopamine receptor D2,至于D1的情况会好一点
点,
我现在在做DR internalization, 试了好几种办法,
不管是Membrane biotinylation,
或者是用Flag M2在没有fix之前去label外膜上的receptor
或者是用Radio ligand来做,
都不是很成功,最近试了一下用Sucrose gradient (35%)来分heavy membrane 和light
vesicle, 应该是有看到了一些internalization.
不过最大的问题是用FLAG M2做完WB后看到的并不是一条单一的带,而是一片
的smear,
应该是某些地方没做好,所以D2R都聚集了
用的是Biorad的SDS loading dye 配方直接溶解膜
或者也试过RIPA和TBS+10%甘油+1%triton
效果都不是太好
但是看了不少paper貌似人家都是做得出来了
这个事情搞了大半年,一直没能搞定,老板又特别楞,从来不给些建设性的意见,每隔
一段时间都要威胁一下做不出来就开除,已经被威胁了十数次,真是有点窘境穷途了,,
,,还能不能接着玩生物就在此一举了
版上卧虎藏龙,人才辈出,有没有玩7TM receptor玩得比较遛的达人给些建议,拉小弟
一把
感激不尽,感激不尽
图做得实在优点丑,惭愧了, 图上的是dopamine receptor D2,至于D1的情况会好一点
点,