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IRES or 2A, 两难。。。

IRES or 2A, 两难。。。# Biology - 生物学

c*r2012-11-29 08:11

1 楼

FYI
http://www.dhs.gov/xlibrary/assets/statistics/publications/lpr_
EB total: 139,339 (less than 140K)
EB1: 25,251
EB2: 66,831
EB3: 37,216
EB4: 6,701
EB5: 3,340
Country of Birth:
Mexico: 143,446, 13.5%
China PR: 87,016, 8.2% (much higher than India)
India: 69,013, 6.5%
Philippines: 57,011, 5.4%
Dominican Republic: 46,109, 4.3%
Last, for fun - Gender:
Male: 480,679, 45.3%
Female: 581,351, 54.7%
Unknown: 10

w*32012-11-29 08:11

2 楼

想换个ipad mini 2。大的拿着不方便
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

j*x2012-11-29 08:11

3 楼

正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
的选择上犯嘀咕啦。
最普通的基本结构：
Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
protein) + pA
困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
（哪位能给推荐一个？）。
简单翻看了之前版上的诸多讨论，还是很难抉择。请诸位经验丰富的先行者给支支招吧
。谢谢！

F*n2012-11-29 08:11

4 楼

不是说EB1都在40000左右么?

【在 c*****r 的大作中提到】

: FYI
: http://www.dhs.gov/xlibrary/assets/statistics/publications/lpr_
: EB total: 139,339 (less than 140K)
: EB1: 25,251
: EB2: 66,831
: EB3: 37,216
: EB4: 6,701
: EB5: 3,340
: Country of Birth:
: Mexico: 143,446, 13.5%

c*l2012-11-29 08:11

5 楼

我过一小时去best buy,回来报告一下

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

【在 w****3 的大作中提到】

: 想换个ipad mini 2。大的拿着不方便
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

t*k2012-11-29 08:11

6 楼

弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。

c*r2012-11-29 08:11

7 楼

40K is the limit. Last year EB1 dropped a lot.

【在 F****n 的大作中提到】

: 不是说EB1都在40000左右么?

t*d2012-11-29 08:11

8 楼

求二手3G ipad。

【在 c**l 的大作中提到】

: 我过一小时去best buy,回来报告一下
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

e*o2012-11-29 08:11

9 楼

如果担心2A的话。就用ires好了。其实还好。把小蛋白/容易表达的放在后面就是了。
用过ires-gfp，觉得还可以。

N*r2012-11-29 08:11

10 楼

FY11 EB1 少了所以ＳＯ有得２０Ｋ＋，Ｅｂ５　也有贡献。
ＦＹ１２　够呛。

c*l2012-11-29 08:11

11 楼

怎么收？什么价？ipad 3 32g white att good condition

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

【在 t*******d 的大作中提到】

: 求二手3G ipad。

j*x2012-11-29 08:11

12 楼

co-translational 'cleavage' 其实本质上是ribosome skipping，在特定位点（2A上
倒数两位G/P之间）上不等正常的肽键形成就跳至下一个codon，从而形成两个独立的蛋
白。

【在 t******k 的大作中提到】

: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。

a*d2012-11-29 08:11

13 楼

那几个unkown是怎么回事情？

w*32012-11-29 08:11

14 楼

希望你拿到好的价格

【在 c**l 的大作中提到】

: 我过一小时去best buy,回来报告一下
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

j*x2012-11-29 08:11

15 楼

IRES的序列和后面ATG的位置据说对表达很关键，眼下手边没有任何商业化的载体，心
里不是很有谱。你这个ires-gfp是根据哪个原始载体设计的呢？另外，ires和前面一个
基因的stop codon离得有多远，这个有影响不？
谢啦

【在 e***o 的大作中提到】

: 如果担心2A的话。就用ires好了。其实还好。把小蛋白/容易表达的放在后面就是了。
: 用过ires-gfp，觉得还可以。

n*y2012-11-29 08:11

16 楼

中国还是不印度拿绿卡的多？难道都是偷渡的？偷渡的算几类呀？

【在 c*****r 的大作中提到】

t*d2012-11-29 08:11

17 楼

VA-MD-DC local？比bestbuy多50可以吧？

【在 c**l 的大作中提到】

: 怎么收？什么价？ipad 3 32g white att good condition
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

l*g2012-11-29 08:11

18 楼

http://www.clontech.com/US/Products/Fluorescent_Proteins_and_Re

【在 j****x 的大作中提到】

: IRES的序列和后面ATG的位置据说对表达很关键，眼下手边没有任何商业化的载体，心
: 里不是很有谱。你这个ires-gfp是根据哪个原始载体设计的呢？另外，ires和前面一个
: 基因的stop codon离得有多远，这个有影响不？
: 谢啦

b*d2012-11-29 08:11

19 楼

政治避难不占名额。

【在 n*****y 的大作中提到】

: 中国还是不印度拿绿卡的多？难道都是偷渡的？偷渡的算几类呀？

c*l2012-11-29 08:11

20 楼

算了，不住一个地方. 先出发了

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

【在 t*******d 的大作中提到】

: VA-MD-DC local？比bestbuy多50可以吧？

T*u2012-11-29 08:11

21 楼

实践证明不是每次都能被切掉。。。

【在 t******k 的大作中提到】

: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。

b*d2012-11-29 08:11

22 楼

unknown是什么？变性？

c*l2012-11-29 08:11

23 楼

靠，才185，不换了，走cl吧

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

【在 c**l 的大作中提到】

: 算了，不住一个地方. 先出发了
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

d*l2012-11-29 08:11

24 楼

买一个载体吧。还是值得的

【在 j****x 的大作中提到】

a*d2012-11-29 08:11

25 楼

家庭移民占了大头。
所以说中国工作类移民命苦，两头受堵：一边是大量的家庭移民，一边是大量的印度
工作移民。
大量的中国家庭移民导致我们EB2必须排期，而大量的印度工作移民则消耗了可能的剩余
名额。

【在 n*****y 的大作中提到】

: 中国还是不印度拿绿卡的多？难道都是偷渡的？偷渡的算几类呀？

w*32012-11-29 08:11

26 楼

32g才185？cl多少钱啊

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 c**l 的大作中提到】

: 靠，才185，不换了，走cl吧
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

s*s2012-11-29 08:11

27 楼

不是2A被切“掉”，而是被切一刀。
前面那个蛋白C段会多一串，后面那个蛋白N段不记得是干净的还是多
几个aa, 反正如果影响定位的话确实很麻烦

【在 t******k 的大作中提到】

: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。

N*g2012-11-29 08:11

28 楼

靠，去年EB-1，3，4，5全都在补贴EB-2啊，EB-3自己都不够吃，还被奥本抠掉2800给
了EB-2。
去年各类别给EB-2贡献名额排名：
EB1: 25,251，贡献1万5
EB5: 3,340，贡献6千6
EB4: 6,701，贡献3千2
EB3: 37,216，贡献2千8 （难能可贵啊！苦不苦，想想长征两万五，累不累，想想阿三亿必三!）

c*l2012-11-29 08:11

29 楼

不知道，而且现在还没有货，小二说可以过两天再来看看。如果有现货估计也就换了。

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

【在 w****3 的大作中提到】

: 32g才185？cl多少钱啊
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

j*x2012-11-29 08:11

30 楼

前面那个蛋白C端多N-1个aa（N是2A的全长，18-20aa吧大概），后面那个N端多一个P
http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
这篇paper也是设计成前一个膜定位后一个核定位，不过前者没有跨膜区，单纯靠N-
Myristoylation来定位，不是很说明问题。
确实很想试试2A的水，纠结啊。。。

【在 s******s 的大作中提到】

: 不是2A被切“掉”，而是被切一刀。
: 前面那个蛋白C段会多一串，后面那个蛋白N段不记得是干净的还是多
: 几个aa, 反正如果影响定位的话确实很麻烦

n*y2012-11-29 08:11

31 楼

中国为什么家庭移民那么多？中国人肯定生不过印度人的，孩子不能多，也没有见很多
中国人把父母给办过来呀？

剩余

【在 a*******d 的大作中提到】

: 家庭移民占了大头。
: 所以说中国工作类移民命苦，两头受堵：一边是大量的家庭移民，一边是大量的印度
: 工作移民。
: 大量的中国家庭移民导致我们EB2必须排期，而大量的印度工作移民则消耗了可能的剩余
: 名额。

t*d2012-11-29 08:11

32 楼

接着求dc local 二手ipad 3，4 or mini cellular版。

【在 c**l 的大作中提到】

: 不知道，而且现在还没有货，小二说可以过两天再来看看。如果有现货估计也就换了。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.1

C*22012-11-29 08:11

33 楼

several articles use 2A peptide as linker to generate transgenic animals,
so, I think that 2A can not induce immune response. Please refer the
following papers.
http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.00

nuclear
2A
响。

【在 j****x 的大作中提到】

: 正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
: 的选择上犯嘀咕啦。
: 最普通的基本结构：
: Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
: protein) + pA
: 困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
: ）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
: peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
: IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
: （哪位能给推荐一个？）。

l*n2012-11-29 08:11

34 楼

父母兄弟姐妹很多呀

【在 n*****y 的大作中提到】

: 中国为什么家庭移民那么多？中国人肯定生不过印度人的，孩子不能多，也没有见很多
: 中国人把父母给办过来呀？
:
: 剩余

c*g2012-11-29 08:11

35 楼

出个ipad 3 16g att送个maroo的真皮套子，300我的label,有人要？

S*s2012-11-29 08:11

36 楼

可以选一个有两个promoter的vector的
或者找一个病毒载体，把上面的selection marker去掉，原来的MCS放你的基因。
这样就没有这个问题了。

nuclear
2A
响。

【在 j****x 的大作中提到】

F*n2012-11-29 08:11

37 楼

前面有人说EB1过去每年都用完40K LIMIT

【在 c*****r 的大作中提到】

: 40K is the limit. Last year EB1 dropped a lot.

j*x2012-11-29 08:11

38 楼

对于transgenic animals，该序列在germline就已经存在了，自然就被识别为自身抗原
而不会引起免疫反应。不是transgenic的话，比如我要先用病毒载体，那么免疫反应就
是一个没法回避的问题了。

【在 C***2 的大作中提到】

: several articles use 2A peptide as linker to generate transgenic animals,
: so, I think that 2A can not induce immune response. Please refer the
: following papers.
: http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
: http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.00
:
: nuclear
: 2A
: 响。

n*y2012-11-29 08:11

39 楼

可能未来十年会好很多，现在生孩子的都是80后了吧，80后没有兄弟姐妹。

【在 l******n 的大作中提到】

: 父母兄弟姐妹很多呀

j*x2012-11-29 08:11

40 楼

这确实是一个办法，不过我要用的其中一个载体，没法这么弄，所以才考虑用一个
cassette搞定所有

【在 S*********s 的大作中提到】

: 可以选一个有两个promoter的vector的
: 或者找一个病毒载体，把上面的selection marker去掉，原来的MCS放你的基因。
: 这样就没有这个问题了。
:
: nuclear
: 2A
: 响。

N*g2012-11-29 08:11

41 楼

去年EB1审批标准一度卡紧，导致很多EB1被RFE,甚至deny，这批EB1很多经过dispute，
拖延到今年，所以去年EB1是小年，但今年EB1很可能是大年，估计这也是奥本始料不及
，急刹车的原因之一

【在 F****n 的大作中提到】

: 前面有人说EB1过去每年都用完40K LIMIT

f*u2012-11-29 08:11

42 楼

两个都做吧，再加上不同的前后顺序，一共四个construct，
也就是一些克隆而已，工作量没增加多少吧

nuclear
2A
响。

【在 j****x 的大作中提到】

c*r2012-11-29 08:11

43 楼

Not every year......
EB1 by fiscal year:
2011 25,251
2010 41,055
2009 40,924
2008 36,678
2007 26,697
2006 36,960
2005 64,731
2004 31,291
2003 14,544
2002 34,452

【在 F****n 的大作中提到】

: 前面有人说EB1过去每年都用完40K LIMIT

P*o2012-11-29 08:11

44 楼

如果在载体递送后很短的时间内（不超过10天？）观察表型，应该没有太大的问题。

【在 j****x 的大作中提到】

: 对于transgenic animals，该序列在germline就已经存在了，自然就被识别为自身抗原
: 而不会引起免疫反应。不是transgenic的话，比如我要先用病毒载体，那么免疫反应就
: 是一个没法回避的问题了。

d*12012-11-29 08:11

45 楼

说道点上了。。是这样。
今年EB1即使有SO也很少。。来个5000就谢上帝了。。

【在 N****g 的大作中提到】

: 去年EB1审批标准一度卡紧，导致很多EB1被RFE,甚至deny，这批EB1很多经过dispute，
: 拖延到今年，所以去年EB1是小年，但今年EB1很可能是大年，估计这也是奥本始料不及
: ，急刹车的原因之一

j*x2012-11-29 08:11

46 楼

确实，还是都试一下做个对比比较保险
先后顺序因为特殊原因是不能变动了，但是对IRES序列我选择了2种不同的类型和设计
，希望至少有一个能满意吧
谢谢建议

【在 f**u 的大作中提到】

: 两个都做吧，再加上不同的前后顺序，一共四个construct，
: 也就是一些克隆而已，工作量没增加多少吧
:
: nuclear
: 2A
: 响。

d*u2012-11-29 08:11

47 楼

算上64的1k就到14w了

【在 c*****r 的大作中提到】

j*x2012-11-29 08:11

48 楼

我们需要相对较长的一段观察时期，10天肯定不够。所以目前打算先用
immunodeficient mice尝试一下，如果靠谱就迅速转向transgenic mice。

【在 P****o 的大作中提到】

: 如果在载体递送后很短的时间内（不超过10天？）观察表型，应该没有太大的问题。

N*g2012-11-29 08:11

49 楼

那1k只扣中国，不扣全世界，全世界还是14w，去年已经很接近了，要完全相等不容易。

【在 d**u 的大作中提到】

: 算上64的1k就到14w了

P*o2012-11-29 08:11

50 楼

如果你的target 细胞是hematopoitic stem cell来源的，也可以试一下HSC
transduciton, 再转到irradiated rag-/- 老鼠。

【在 j****x 的大作中提到】

: 我们需要相对较长的一段观察时期，10天肯定不够。所以目前打算先用
: immunodeficient mice尝试一下，如果靠谱就迅速转向transgenic mice。

N*r2012-11-29 08:11

51 楼

不明白６。４　的１Ｋ就不是政难？
怎么就算是Ｅ类的？
搞不清这里的逻辑。

N*r2012-11-29 08:11

52 楼

不明白６。４　的１Ｋ就不是政难？
怎么就算是Ｅ类的？
搞不清这里的逻辑。

b*d2012-11-29 08:11

53 楼

不是政难。是国会通过的特别法案给的。

【在 N*******r 的大作中提到】

: 不明白６。４　的１Ｋ就不是政难？
: 怎么就算是Ｅ类的？
: 搞不清这里的逻辑。

a*d2012-11-29 08:11

54 楼

又是佩洛西吧

【在 b*****d 的大作中提到】

: 不是政难。是国会通过的特别法案给的。

b*d2012-11-29 08:11

55 楼

嗯。是她
1992年中国学生保护法案（英语：Chinese Student Protection Act of 1992，简称“
CSPA”）是一项由时任美国联邦众议员的加利福尼亚州籍民主党人南希·佩洛西提出的
、旨在给予所有在1990年4月11日之前抵达美国的中华人民共和国国民永久居留权的法
案。[1] 这项法案的通过还使得时任美国总统乔治·H·W·布什于1990年签署的第
12711号总统令（Executive Order 12711）中规定的“暂时禁止将中国国民驱逐出境”
成为永久性条款。
本法案中规定，给予中国国民的永久居留权名额如超出当年规定限额，将从次年的移民
名额空间中减去相应数量。制定该法案的目标是为了使中国学生在六四事件之后免遭政
治迫害。

【在 a*******d 的大作中提到】

: 又是佩洛西吧

w*s2012-11-29 08:11

56 楼

政庀及其家属占了大部分名额。
EB类结婚的都不占大多数。

N*r2012-11-29 08:11

57 楼

“制定该法案的目标是为了使中国学生在六四事件之后免遭政治迫害。”
法案本身的内容就是不折不扣的政治庇护，为什么要占移民的名额。还是Ｅ类。
就没人提出质疑？

n*s2012-11-29 08:11

58 楼

看来卡EB1是EB2大潮的关键！
2011 25,251 -- 大潮
2007 26,697 -- 大潮
next 大潮？你们还是活动要求严格EB1的标准(EB1A,B, and C)。这样少下来的就会SO到EB2.

【在 c*****r 的大作中提到】

: Not every year......
: EB1 by fiscal year:
: 2011 25,251
: 2010 41,055
: 2009 40,924
: 2008 36,678
: 2007 26,697
: 2006 36,960
: 2005 64,731
: 2004 31,291

d*u2012-11-29 08:11

59 楼

找到上次你和Helsinki讨论这个问题的帖子了。我居然把最后结论记反了。

易。

【在 N****g 的大作中提到】

: 那1k只扣中国，不扣全世界，全世界还是14w，去年已经很接近了，要完全相等不容易。

a*d2012-11-29 08:11

60 楼

佩洛西能干啥好事？
回想07大潮，施压不允许奥傻提前关门的也是她。

【在 N*******r 的大作中提到】

: “制定该法案的目标是为了使中国学生在六四事件之后免遭政治迫害。”
: 法案本身的内容就是不折不扣的政治庇护，为什么要占移民的名额。还是Ｅ类。
: 就没人提出质疑？