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[请教] 怎样设计原位杂交的探针?

[请教] 怎样设计原位杂交的探针?# Biology - 生物学

n*l2013-01-06 08:01

1 楼

实验室新项目,我真是两眼一抹黑,周围也找不到可以指导的人.
1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
呢?
2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
真的是请前辈不吝赐教,在下不胜感激!

n*l2013-01-06 08:01

2 楼

还有一个问题,这个probo的长度多少合适?是不是要跨内含子?谢谢

x*e2013-01-06 08:01

3 楼

1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
呢?
是的，我们一般都用cRNA做探针。
2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
没做过FISH，不过做FISH的探针要考虑荧光的强度，很多公司，比如IDT，可以合成，
但只能在5‘末端加一个荧光基团，强度可能不够，自己合成的话可以将所有的U的添加
一个荧光基团，荧光强度要大数十倍。
3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
我做的都是石蜡的，必须要蛋白酶K处理。
探针在100bp左右为佳，是否跨内含子不清楚，我的没有跨过。

n*l2013-01-06 08:01

4 楼

谢谢您的回复。
我也是看到说probe要100bp左右。但是也找到一个公司，EXIQON，online的软件给的
probe都只有20bp多，也只能带1个或者2个荧光基团.
想请教如果自己合成，是象合成引物那样，给序列公司合成后，自己用试剂盒label荧
光么？
还有就是你们为什么用石蜡的呢？他比冰冻切片更好么？因为以前我们做免疫荧光基本
都是用冰冻的，觉得石蜡步骤繁多，又爱脱片。
谢谢

【在 x**e 的大作中提到】

: 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
: 呢?
: 是的，我们一般都用cRNA做探针。
: 2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
: FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
: 没做过FISH，不过做FISH的探针要考虑荧光的强度，很多公司，比如IDT，可以合成，
: 但只能在5‘末端加一个荧光基团，强度可能不够，自己合成的话可以将所有的U的添加
: 一个荧光基团，荧光强度要大数十倍。
: 3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
: 我做的都是石蜡的，必须要蛋白酶K处理。

c*r2013-01-06 08:01

5 楼

这个current protocols应该有现成的protocol吧？

【在 n*****l 的大作中提到】

: 实验室新项目,我真是两眼一抹黑,周围也找不到可以指导的人.
: 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
: 呢?
: 2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
: FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
: 3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
: 真的是请前辈不吝赐教,在下不胜感激!

n*l2013-01-06 08:01

6 楼

我有protocol, 只是很多细节的东西,希望能得到前辈的真传少走弯路.

【在 c******r 的大作中提到】

: 这个current protocols应该有现成的protocol吧？

n*x2013-01-06 08:01

7 楼

试试这个，领域内最好的ISH技术：
http://www.acdbio.com/

【在 n*****l 的大作中提到】

g*n2013-01-06 08:01

8 楼

1. cRNA
2. 500-1000
3. DIG. Anti-DiG antibody-FTLC
4. Probe to 3' region of target mRNA, avoid conserved seq as much as
possible.
5. Paraffin sections good morph, low signal. Frozen bad morph high signal.
6. Protease K yes. But be careful, sections can fall off.

n*l2013-01-06 08:01

9 楼

Thank you so much!

【在 g*****n 的大作中提到】

: 1. cRNA
: 2. 500-1000
: 3. DIG. Anti-DiG antibody-FTLC
: 4. Probe to 3' region of target mRNA, avoid conserved seq as much as
: possible.
: 5. Paraffin sections good morph, low signal. Frozen bad morph high signal.
: 6. Protease K yes. But be careful, sections can fall off.