一个条件性细胞剔除模式小鼠# Biology - 生物学
C*4
1 楼
一个条件性细胞剔除模式小鼠的诞生 (2013-02-22 18:10:22)转载▼
标签： talen 创业 大鼠基因敲除 基因敲除 杂谈 分类： 个人随笔
对于基因敲除（gene knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因
在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一
个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B
细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫
细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器
官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生
抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人
发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一
个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin, 简
称DT）大家可能知道，很多小孩子得过白喉blabla。DT这东西通过跟细胞表面一种叫白
喉毒素受体（DT receptor，简称DTR）的蛋白结合，然后这个毒素就被带进了细胞内，
再然后就通过据说是抑制蛋白合成还是什么机制把细胞废掉。但这种DTR只在灵长类（
比如人呀，猴呀）有，小鼠等啮齿类动物没有。也就是说你给小鼠注射一大堆DT进去，
小鼠也依然安然无恙。所以就有聪明人想，可以让小鼠某些细胞表达DTR，然后给小鼠
注射一针DT就可以把这种有DTR的细胞干掉，也就是我题目讲的细胞清除。如果在给DTR
加一个标签（EGFP），这样还可以看看到底哪个细胞绿了（EGFP），再给小鼠肚子上来
一针DT，piapia，绿细胞不见了。多神奇呀。这种方法最早是被用来剔除树突状细胞（
dendritic cells, 简称DC）（2002年）。Jung等将DTR-EGFP这个融合蛋白放在DC细胞
特异分子CD11c启动子控制之下，做了一个转基因小鼠。注射一针DT之后，DC真的不见
了。然后发在了一个叫Immunity的杂志上。这样后来人就用它来研究DC细胞在体内do
what啦。后来这个DTR-EGFP融合蛋白基因又被用来剔除巨噬细胞（CD11b）(Duffield
JS)，Lgr5肿瘤干细胞（如果真有的话）（Tian H, et al）和调节性T细胞(FoxP3)（
Rudensky A. et al.）。关于这个剔除调节性T细胞。想当年我也做了这个FoxP3-DTR-
EGFP，做出来比Rudensky实验室还早呢，但是愣是被他们先发了，从此也奠定了我彻底
离开学术界的不归路。
为了使这个DTR用途更广，有人把它放在了Rosa26启动子下（Buch T, et al.），
叫Rosa-iDTR小鼠。其实是在Rosa26启动子跟DTR之间放了一个loxP-STOP-loxP（Rosa26
-loxP-STOP-loxP-DTR）。正常情况下，这个小鼠里哪个细胞都不会表达DTR，因为在
Rosa26启动子和DTR之间有一个大大的”STOP”，Rosa26启动子够不到DTR。可是当这个
小鼠跟Cre小鼠结婚生子之后，小鼠仔们哪个细胞有Cre，哪个细胞就会有DTR，因为Cre
这把剪刀把“STOP”移走了，这样Rosa26启动子就够到了DTR（Rosa26-loxP-DTR）。这
个时候再给小鼠DT，DT杀哪个细胞就完全看Cre在哪个细胞了。
我自己是学免疫的。尽管有人可能不同意，我自个儿还是觉得免疫学的核心问题是
一种将“免疫记忆”的东西。比如天花，人接种之后一辈子也不再得了。而有些疫苗接
种之后几个月就不保护了；更有甚这有些家伙根本引不起免疫记忆，当然也不可能用它
来做疫苗了。尽管免疫学研究已经有上百年的历史了，但直到现在我们对于免疫记忆的
起始、维持和消亡的分子机制也很不了解。当然也有人说自己特别了解的，就像很多神
父说了解圣经里的每一句话。但当你问他蛇在引诱夏娃吃那个水果之前是怎么走路的时
候，他可能真不知道。 如果了解了免疫记忆的机制，就可以更好地设计疫苗，增强人
民体质，进而保家卫国。我在读博士的时候就对这个大课题特别感兴趣，然后做博士后
开始研究模式动物，觉得可以对免疫记忆做些研究了，当然最后我不成功。当时还没有
rosa-iDTR（这个小鼠没有EGFP）的时候我就想，如果我做一个Rosa-iDTR-EGFP小鼠，
然后做无数的Cre小鼠，这样我就可以把细胞一群一群的杀死，就可以知道哪些细胞对
免疫记忆有帮助。举个例子吧，假如说表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关系，那我可以做
一个IL6-Cre小鼠，然后跟Rosa-iDTR-EGFP小鼠交配。得到的小鼠先用病毒感染一次，
这个时候只要是曾经表达过IL-6的细胞都是绿色的，并且都带有了DTR。这样我可以把
EGFP阳性的细胞分离出来，转到另一只小鼠里，看是不是可以把免疫记忆带过去。或是
在第二次病毒感染之前，先给小鼠来一针DT，这样只要是曾经表达过IL-6的细胞就都被
干掉了，然后再看是不是把免疫记忆也顺带给干掉了。如果结果真是这样，至少可以说
明表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关，咱再往下研究就是了。哇塞，那个时候我发财了，
至少发一篇超过15分的文章有可能吧。当然恰好是IL-6的可能性不是很大。但我可以把
所有的细胞因子全做成cre小鼠呀，是不是成功的可能性就大起来了呢？很可惜我的博
士后生涯结束了，做一个小公司，也可以把这个做出来呀。
公司一旦能够开始做基因敲除小鼠了，我就想终于可以开始把这个模型做出来了。
下面就是设计思考怎么做了。通过我自己的经验和发表的文章，这个DTR-EGFP融合蛋白
信号特别弱。如果比较一下CD11c-EYFP跟CD11c-DTR-EGFP; 或是FoxP3-EGFP和FoxP3-
DTR-EGFP，信号强度简直是一个天上一个地下。说明这个DTR和EGFP互相处不好。所以
我就想对这个做一个改造，把DTR-EGFP融合蛋白做成DTR-2A-EGFP，这样这俩哥们一起
被表达出来，但表达完就分开了，互不干扰。这个时候就可以把DTR-2A-EGFP放在
rosa26位置了。且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单基因，阳性
跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能够看到EGFP
信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这家伙不但动
力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就开始做一个
叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠。 我得意呀，觉得可以找一批人做免
疫记忆了。但我们的投资人给了我当头棒喝，说不能把公司做成研究所。做公司了还老
想着科研，简直就是婚姻里找小三儿，必须坚决悔改，主要是改。也就是做公司必须以
盈利为目的。我绝望了一阵，然后想，既然不让我自己做，我也可以给别人呀。他们发
文章，然后说老鼠是我们这里来的，说不定谁还把我名字挂在他们文章里，也挺美的呀。
去年9月这个小鼠出来了，先把种群扩起来，从一个到几十个。然后就想得到的小
鼠跟我预期的是不是一回事儿？于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre
小鼠交配，年前得到了一只CD19Cre/Rosa-iDTRGFP小鼠。因为只有珍贵的一只，所以先
采血看看是不是有GFP信号。答案是有，还不错（Fig 1a）。至少是目前为止看到的DTR
-EGFP中信号最好的。下面就是要看DT是不是可以把这群EGFP细胞给杀死。只有一只小
鼠，也没有对照，咱也不能直接一针进去，还没有个重复。所以我们就把这个小鼠的脾
脏个取出来，然后把它的所有细胞洗吧洗吧再转到另外几只小鼠之中，这个时候再注射
DT。24小时候，采点血看看见分晓了。没有注射DT的小鼠，EGFP阳性细胞还在；注射DT
的小鼠呢，EGFP阳性细胞不见了（Fig 1b）。说明这个小鼠是成功的。
那这个工具鼠怎么用呢？海了去了。我列几个我自己感兴趣的。
比如我想研究I型糖尿病，我就可以把这个小鼠跟胰岛细胞特异的Cre小鼠交配，然
后所有胰岛细胞都是绿的。然后注射DT就可以让beta细胞仙去，这个小鼠都没有胰岛素
了，就得了糖尿病，当然这个是非常干净的I型糖尿病模型。刚出的973项目有个课题是
研究I型糖尿病引起的继发性器官衰竭机制和干预的，这是一个多好的模型呀。比用STZ
诱导干净多了。 当然我们是公司，没有资格申请这种高水平的国家大课题。现在细胞
治疗很火。如果想做胰岛细胞移植治疗，研究者最担心的就是受体鼠本身beta细胞去不
干净，还会再生。你把自己用ES/iPS好不容易分化出来的beta细胞打进去，检测胰岛素
，不知道是自己打进去的beta细胞产生的呢，还是受体小鼠自身当初没有杀干净的beta
细胞产生的。多影响情绪呀。如果用我们这个小鼠，你把自己的细胞漂红，小鼠的细胞
是绿的，直接就可以用眼看。最不济还可以不断注射DT，让小鼠自己没有产生新胰岛细
胞的机会。如果把这个小鼠跟NSG小鼠交配，说不定就可以直接研究从人iPS来的beta细
胞的功能应用了，这是不是可以更快地上临床呢？
还有人想研究肝脏再生机制的。可以把这个小鼠跟albumin-cre小鼠交配，让所有
肝细胞都变绿带DTR。再通过不同剂量的DT来杀死肝细胞，研究肝损伤多好呀。如果是
NSG背景，不用做手术就可以做人鼠嵌合肝移植了。对药物研究多有贡献呀。
这个用途很广，想杀谁杀谁，完全看你不喜欢哪个细胞。管你是神经、癌症、心脏
、肺脏的。当然还有我最欣赏的免疫细胞。如果有人想做免疫记忆的话，这个工具鼠就
是真正找到了归宿。
现在种群不是很大，只有几十只，先给老客户，然后给不是客户的客户。我相信今
后会有成百上千的文章是用这个小鼠做出来的。
标签： talen 创业 大鼠基因敲除 基因敲除 杂谈 分类： 个人随笔
对于基因敲除（gene knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因
在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一
个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B
细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫
细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器
官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生
抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人
发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一
个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin, 简
称DT）大家可能知道，很多小孩子得过白喉blabla。DT这东西通过跟细胞表面一种叫白
喉毒素受体（DT receptor，简称DTR）的蛋白结合，然后这个毒素就被带进了细胞内，
再然后就通过据说是抑制蛋白合成还是什么机制把细胞废掉。但这种DTR只在灵长类（
比如人呀，猴呀）有，小鼠等啮齿类动物没有。也就是说你给小鼠注射一大堆DT进去，
小鼠也依然安然无恙。所以就有聪明人想，可以让小鼠某些细胞表达DTR，然后给小鼠
注射一针DT就可以把这种有DTR的细胞干掉，也就是我题目讲的细胞清除。如果在给DTR
加一个标签（EGFP），这样还可以看看到底哪个细胞绿了（EGFP），再给小鼠肚子上来
一针DT，piapia，绿细胞不见了。多神奇呀。这种方法最早是被用来剔除树突状细胞（
dendritic cells, 简称DC）（2002年）。Jung等将DTR-EGFP这个融合蛋白放在DC细胞
特异分子CD11c启动子控制之下，做了一个转基因小鼠。注射一针DT之后，DC真的不见
了。然后发在了一个叫Immunity的杂志上。这样后来人就用它来研究DC细胞在体内do
what啦。后来这个DTR-EGFP融合蛋白基因又被用来剔除巨噬细胞（CD11b）(Duffield
JS)，Lgr5肿瘤干细胞（如果真有的话）（Tian H, et al）和调节性T细胞(FoxP3)（
Rudensky A. et al.）。关于这个剔除调节性T细胞。想当年我也做了这个FoxP3-DTR-
EGFP，做出来比Rudensky实验室还早呢，但是愣是被他们先发了，从此也奠定了我彻底
离开学术界的不归路。
为了使这个DTR用途更广，有人把它放在了Rosa26启动子下（Buch T, et al.），
叫Rosa-iDTR小鼠。其实是在Rosa26启动子跟DTR之间放了一个loxP-STOP-loxP（Rosa26
-loxP-STOP-loxP-DTR）。正常情况下，这个小鼠里哪个细胞都不会表达DTR，因为在
Rosa26启动子和DTR之间有一个大大的”STOP”，Rosa26启动子够不到DTR。可是当这个
小鼠跟Cre小鼠结婚生子之后，小鼠仔们哪个细胞有Cre，哪个细胞就会有DTR，因为Cre
这把剪刀把“STOP”移走了，这样Rosa26启动子就够到了DTR（Rosa26-loxP-DTR）。这
个时候再给小鼠DT，DT杀哪个细胞就完全看Cre在哪个细胞了。
我自己是学免疫的。尽管有人可能不同意，我自个儿还是觉得免疫学的核心问题是
一种将“免疫记忆”的东西。比如天花，人接种之后一辈子也不再得了。而有些疫苗接
种之后几个月就不保护了；更有甚这有些家伙根本引不起免疫记忆，当然也不可能用它
来做疫苗了。尽管免疫学研究已经有上百年的历史了，但直到现在我们对于免疫记忆的
起始、维持和消亡的分子机制也很不了解。当然也有人说自己特别了解的，就像很多神
父说了解圣经里的每一句话。但当你问他蛇在引诱夏娃吃那个水果之前是怎么走路的时
候，他可能真不知道。 如果了解了免疫记忆的机制，就可以更好地设计疫苗，增强人
民体质，进而保家卫国。我在读博士的时候就对这个大课题特别感兴趣，然后做博士后
开始研究模式动物，觉得可以对免疫记忆做些研究了，当然最后我不成功。当时还没有
rosa-iDTR（这个小鼠没有EGFP）的时候我就想，如果我做一个Rosa-iDTR-EGFP小鼠，
然后做无数的Cre小鼠，这样我就可以把细胞一群一群的杀死，就可以知道哪些细胞对
免疫记忆有帮助。举个例子吧，假如说表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关系，那我可以做
一个IL6-Cre小鼠，然后跟Rosa-iDTR-EGFP小鼠交配。得到的小鼠先用病毒感染一次，
这个时候只要是曾经表达过IL-6的细胞都是绿色的，并且都带有了DTR。这样我可以把
EGFP阳性的细胞分离出来，转到另一只小鼠里，看是不是可以把免疫记忆带过去。或是
在第二次病毒感染之前，先给小鼠来一针DT，这样只要是曾经表达过IL-6的细胞就都被
干掉了，然后再看是不是把免疫记忆也顺带给干掉了。如果结果真是这样，至少可以说
明表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关，咱再往下研究就是了。哇塞，那个时候我发财了，
至少发一篇超过15分的文章有可能吧。当然恰好是IL-6的可能性不是很大。但我可以把
所有的细胞因子全做成cre小鼠呀，是不是成功的可能性就大起来了呢？很可惜我的博
士后生涯结束了，做一个小公司，也可以把这个做出来呀。
公司一旦能够开始做基因敲除小鼠了，我就想终于可以开始把这个模型做出来了。
下面就是设计思考怎么做了。通过我自己的经验和发表的文章，这个DTR-EGFP融合蛋白
信号特别弱。如果比较一下CD11c-EYFP跟CD11c-DTR-EGFP; 或是FoxP3-EGFP和FoxP3-
DTR-EGFP，信号强度简直是一个天上一个地下。说明这个DTR和EGFP互相处不好。所以
我就想对这个做一个改造，把DTR-EGFP融合蛋白做成DTR-2A-EGFP，这样这俩哥们一起
被表达出来，但表达完就分开了，互不干扰。这个时候就可以把DTR-2A-EGFP放在
rosa26位置了。且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单基因，阳性
跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能够看到EGFP
信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这家伙不但动
力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就开始做一个
叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP的工具鼠。 我得意呀，觉得可以找一批人做免
疫记忆了。但我们的投资人给了我当头棒喝，说不能把公司做成研究所。做公司了还老
想着科研，简直就是婚姻里找小三儿，必须坚决悔改，主要是改。也就是做公司必须以
盈利为目的。我绝望了一阵，然后想，既然不让我自己做，我也可以给别人呀。他们发
文章，然后说老鼠是我们这里来的，说不定谁还把我名字挂在他们文章里，也挺美的呀。
去年9月这个小鼠出来了，先把种群扩起来，从一个到几十个。然后就想得到的小
鼠跟我预期的是不是一回事儿？于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre
小鼠交配，年前得到了一只CD19Cre/Rosa-iDTRGFP小鼠。因为只有珍贵的一只，所以先
采血看看是不是有GFP信号。答案是有，还不错（Fig 1a）。至少是目前为止看到的DTR
-EGFP中信号最好的。下面就是要看DT是不是可以把这群EGFP细胞给杀死。只有一只小
鼠，也没有对照，咱也不能直接一针进去，还没有个重复。所以我们就把这个小鼠的脾
脏个取出来，然后把它的所有细胞洗吧洗吧再转到另外几只小鼠之中，这个时候再注射
DT。24小时候，采点血看看见分晓了。没有注射DT的小鼠，EGFP阳性细胞还在；注射DT
的小鼠呢，EGFP阳性细胞不见了（Fig 1b）。说明这个小鼠是成功的。
那这个工具鼠怎么用呢？海了去了。我列几个我自己感兴趣的。
比如我想研究I型糖尿病，我就可以把这个小鼠跟胰岛细胞特异的Cre小鼠交配，然
后所有胰岛细胞都是绿的。然后注射DT就可以让beta细胞仙去，这个小鼠都没有胰岛素
了，就得了糖尿病，当然这个是非常干净的I型糖尿病模型。刚出的973项目有个课题是
研究I型糖尿病引起的继发性器官衰竭机制和干预的，这是一个多好的模型呀。比用STZ
诱导干净多了。 当然我们是公司，没有资格申请这种高水平的国家大课题。现在细胞
治疗很火。如果想做胰岛细胞移植治疗，研究者最担心的就是受体鼠本身beta细胞去不
干净，还会再生。你把自己用ES/iPS好不容易分化出来的beta细胞打进去，检测胰岛素
，不知道是自己打进去的beta细胞产生的呢，还是受体小鼠自身当初没有杀干净的beta
细胞产生的。多影响情绪呀。如果用我们这个小鼠，你把自己的细胞漂红，小鼠的细胞
是绿的，直接就可以用眼看。最不济还可以不断注射DT，让小鼠自己没有产生新胰岛细
胞的机会。如果把这个小鼠跟NSG小鼠交配，说不定就可以直接研究从人iPS来的beta细
胞的功能应用了，这是不是可以更快地上临床呢？
还有人想研究肝脏再生机制的。可以把这个小鼠跟albumin-cre小鼠交配，让所有
肝细胞都变绿带DTR。再通过不同剂量的DT来杀死肝细胞，研究肝损伤多好呀。如果是
NSG背景，不用做手术就可以做人鼠嵌合肝移植了。对药物研究多有贡献呀。
这个用途很广，想杀谁杀谁，完全看你不喜欢哪个细胞。管你是神经、癌症、心脏
、肺脏的。当然还有我最欣赏的免疫细胞。如果有人想做免疫记忆的话，这个工具鼠就
是真正找到了归宿。
现在种群不是很大，只有几十只，先给老客户，然后给不是客户的客户。我相信今
后会有成百上千的文章是用这个小鼠做出来的。
