shRNA cloning site of pGIPZ?# Biology - 生物学
a*3
1 楼
如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
x*9
2 楼
前天的圣诞节儿子和朋友们举办了两场音乐会，不仅是社区人士我们这些老妈老爸也跟
着过了把瘾，享受了音乐，最要紧的，免费的噢！！
不好意思，儿子现在的头发老长，让他去剪个头那叫一个难，简直是“护法大师”啊，
剪一寸头发价值我很多的唇舌。
不好意思，只好来两张以前的片片，还能冒充一下帅哥的干活:p
这两次的音乐会视频比较分散，有的是一个视频里两个曲子，有的是一个视频里一个曲
子，下面是第一场音乐会的开场段，更多的请到他们的油管频道 "
MusicEndlessSunrise"
http://www.youtube.com/user/MusicEndlessSunrise#p/u/4/CTbfqE3Ap
更多的请到他们的油管频道 "MusicEndlessSunrise"
http://www.youtube.com/user/MusicEndlessSunrise
着过了把瘾，享受了音乐，最要紧的，免费的噢！！
不好意思，儿子现在的头发老长，让他去剪个头那叫一个难，简直是“护法大师”啊，
剪一寸头发价值我很多的唇舌。
不好意思，只好来两张以前的片片，还能冒充一下帅哥的干活:p
这两次的音乐会视频比较分散，有的是一个视频里两个曲子，有的是一个视频里一个曲
子，下面是第一场音乐会的开场段，更多的请到他们的油管频道 "
MusicEndlessSunrise"
http://www.youtube.com/user/MusicEndlessSunrise#p/u/4/CTbfqE3Ap
更多的请到他们的油管频道 "MusicEndlessSunrise"
http://www.youtube.com/user/MusicEndlessSunrise
s*g
3 楼
我的出生证明已经丢失了， 要办出生证明的公证是不是凭借户口本在当地公安局办，
然后在当地的公证处公证即可。
然后在当地的公证处公证即可。
y*m
4 楼
从工资里扣，但file 140时要提交工资单(从perm aprrove后的么？)，
deduct后 YTD 变了是否会被 USCIS audit? thx!
deduct后 YTD 变了是否会被 USCIS audit? thx!
s*y
5 楼
我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
这个质粒的用法也描述得非常含糊。
我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
这个质粒的用法也描述得非常含糊。
我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
m*l
6 楼
对于国人来讲，实际上比10%还低的多。平衡国籍的
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
x*9
7 楼
图片发不上去，点下面看
A*T
8 楼
对
【在 s****g 的大作中提到】
: 我的出生证明已经丢失了， 要办出生证明的公证是不是凭借户口本在当地公安局办，
: 然后在当地的公证处公证即可。
【在 s****g 的大作中提到】
: 我的出生证明已经丢失了， 要办出生证明的公证是不是凭借户口本在当地公安局办，
: 然后在当地的公证处公证即可。
y*7
9 楼
工资应该看得是gross pay吧，和你deduct不deduct没有什么关系吧
a*n
10 楼
这样不行。XhoI和BamH1之间还有部分miR30的序列。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
F*y
11 楼
日本的研究申请是有自己严格的写作格式和审查形式的。
这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
申请不是你一个人完成的。
尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
申请不是你一个人完成的。
尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
x*9
12 楼
自己顶一下！
y*m
13 楼
请假no pay啥导致 net income -- 不影响 gross pay，不被audit就好
thx!
【在 y*****7 的大作中提到】
: 工资应该看得是gross pay吧，和你deduct不deduct没有什么关系吧
thx!
【在 y*****7 的大作中提到】
: 工资应该看得是gross pay吧，和你deduct不deduct没有什么关系吧
s*y
14 楼
那到底应该用哪两个酶啊？今天我打电话问了公司里的人，他们说应该先用
XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
【在 a****n 的大作中提到】
: 这样不行。XhoI和BamH1之间还有部分miR30的序列。
XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
【在 a****n 的大作中提到】
: 这样不行。XhoI和BamH1之间还有部分miR30的序列。
q*n
15 楼
这个申了之后有啥特别的好处吗？
有好处的话，我也要去申！
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
有好处的话，我也要去申！
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
g*s
16 楼
赞帅哥！多大了？
琴拉得不错！几岁开始学的？
琴拉得不错！几岁开始学的？
g*g
17 楼
找死
l*g
18 楼
http://www.bmgc.umn.edu/prod/groups/ahc/@pub/@ahc/@bmgc/documen
Page 6
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
Page 6
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
a*3
19 楼
工资蛮高，36万日元，约合人民币2万左右吧。还有一笔特别研究员奖励费，120万日元
左右，约合人民币8-9万左右。不过任期有限，最多两年。你可以尝试一下，现在正在
募集，不过五月六号就截止（学术振兴会的截止日期）。每个大学的申请截止日期还不
一样，我所在的大学就是这个月十四号。
你可以申请明年四月开始的。
http://www.jsps.go.jp/j-fellow/j-fellow_14/31_boshuyoko_h28.htm
链接如上，希望有用。
【在 q***n 的大作中提到】
: 这个申了之后有啥特别的好处吗？
: 有好处的话，我也要去申！
左右，约合人民币8-9万左右。不过任期有限，最多两年。你可以尝试一下，现在正在
募集，不过五月六号就截止（学术振兴会的截止日期）。每个大学的申请截止日期还不
一样，我所在的大学就是这个月十四号。
你可以申请明年四月开始的。
http://www.jsps.go.jp/j-fellow/j-fellow_14/31_boshuyoko_h28.htm
链接如上，希望有用。
【在 q***n 的大作中提到】
: 这个申了之后有啥特别的好处吗？
: 有好处的话，我也要去申！
o*4
20 楼
这么麻烦啊，为啥不用pLKO.1，
克隆超级简单
【在 s******y 的大作中提到】
: 那到底应该用哪两个酶啊？今天我打电话问了公司里的人，他们说应该先用
: XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
: 接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
: 。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
克隆超级简单
【在 s******y 的大作中提到】
: 那到底应该用哪两个酶啊？今天我打电话问了公司里的人，他们说应该先用
: XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
: 接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
: 。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
a*3
21 楼
谢谢回复兼鼓励！
抱歉没有说明清楚，我现在就是在日本的大学里做研究工作。
申请已经提交，希望不是去做分母的。
【在 F***y 的大作中提到】
: 日本的研究申请是有自己严格的写作格式和审查形式的。
: 这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
: 最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
: 而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
: 申请不是你一个人完成的。
: 尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
: 校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
: 而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
抱歉没有说明清楚，我现在就是在日本的大学里做研究工作。
申请已经提交，希望不是去做分母的。
【在 F***y 的大作中提到】
: 日本的研究申请是有自己严格的写作格式和审查形式的。
: 这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
: 最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
: 而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
: 申请不是你一个人完成的。
: 尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
: 校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
: 而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
a*n
22 楼
他们其实是用XhoI 和 EcoRI 插入shRNA序列的。详细序列见：
http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
q*n
23 楼
超级感谢！！
【在 a**********3 的大作中提到】
: 工资蛮高，36万日元，约合人民币2万左右吧。还有一笔特别研究员奖励费，120万日元
: 左右，约合人民币8-9万左右。不过任期有限，最多两年。你可以尝试一下，现在正在
: 募集，不过五月六号就截止（学术振兴会的截止日期）。每个大学的申请截止日期还不
: 一样，我所在的大学就是这个月十四号。
: 你可以申请明年四月开始的。
: http://www.jsps.go.jp/j-fellow/j-fellow_14/31_boshuyoko_h28.htm
: 链接如上，希望有用。
【在 a**********3 的大作中提到】
: 工资蛮高，36万日元，约合人民币2万左右吧。还有一笔特别研究员奖励费，120万日元
: 左右，约合人民币8-9万左右。不过任期有限，最多两年。你可以尝试一下，现在正在
: 募集，不过五月六号就截止（学术振兴会的截止日期）。每个大学的申请截止日期还不
: 一样，我所在的大学就是这个月十四号。
: 你可以申请明年四月开始的。
: http://www.jsps.go.jp/j-fellow/j-fellow_14/31_boshuyoko_h28.htm
: 链接如上，希望有用。
s*y
24 楼
谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
的序列？）
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们其实是用XhoI 和 EcoRI 插入shRNA序列的。详细序列见：
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
的序列？）
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们其实是用XhoI 和 EcoRI 插入shRNA序列的。详细序列见：
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
I*A
25 楼
看你申请的是一般还是定着促进
后者的比例很低
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
后者的比例很低
【在 a**********3 的大作中提到】
: 如题。有人申请过吗？想了一个研究计划和自己以前做的关系不是特别大，没有连续性
: 。没有任何preliminary data,感觉应该没有什么可能中，就冲这10%的录取率。
s*y
26 楼
由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
，如果你知道的话麻烦推荐一下。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这么麻烦啊，为啥不用pLKO.1，
: 克隆超级简单
的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
，如果你知道的话麻烦推荐一下。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这么麻烦啊，为啥不用pLKO.1，
: 克隆超级简单
a*3
27 楼
是一般类的
【在 I***A 的大作中提到】
: 看你申请的是一般还是定着促进
: 后者的比例很低
【在 I***A 的大作中提到】
: 看你申请的是一般还是定着促进
: 后者的比例很低
X*n
28 楼
那你应该用诱导型的载体吧？
你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30.
你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30.
A*0
29 楼
请教啥是定着促进？
【在 I***A 的大作中提到】
: 看你申请的是一般还是定着促进
: 后者的比例很低
【在 I***A 的大作中提到】
: 看你申请的是一般还是定着促进
: 后者的比例很低
s*y
30 楼
诱导性的一般都是tet, 这个对我们的细胞有很强的影响。综合了各种考虑之后，
我们暂时决定还是用一般的载体，而不是诱导型的。当然以后不排除会用诱导型的
来做一些confirmation test.
【在 X******n 的大作中提到】
: 那你应该用诱导型的载体吧？
: 你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
: 我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30.
我们暂时决定还是用一般的载体，而不是诱导型的。当然以后不排除会用诱导型的
来做一些confirmation test.
【在 X******n 的大作中提到】
: 那你应该用诱导型的载体吧？
: 你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
: 我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30.
a*3
31 楼
是给打算长期在日本高校或研究机构从事科研职的外国人申请的，老板要够牛，学校基
本都是日本top大学
【在 A****0 的大作中提到】
: 请教啥是定着促进？
本都是日本top大学
【在 A****0 的大作中提到】
: 请教啥是定着促进？
H*i
32 楼
用LacI/IPTG在真核细胞里有啥问题么？
F*y
33 楼
申请前提是PD后留校任教。其背景是外国人PD结束后，在日本找不到工作，日本政府觉
得花了冤枉钱，硬性特意发展定着促进。
类似政府给大学免费提供一个PD2年给大学工作，然后大学保证给这个PD一份教职。一
旦进入教职，所有费用就是大学来承担。
这样需要大学占用一个教职位子，很少有大学愿意申请这个项目，除非是教授想把自己
的学生留下，还可以在教授会上一拼。
【在 A****0 的大作中提到】
: 请教啥是定着促进？
得花了冤枉钱，硬性特意发展定着促进。
类似政府给大学免费提供一个PD2年给大学工作，然后大学保证给这个PD一份教职。一
旦进入教职，所有费用就是大学来承担。
这样需要大学占用一个教职位子，很少有大学愿意申请这个项目，除非是教授想把自己
的学生留下，还可以在教授会上一拼。
【在 A****0 的大作中提到】
: 请教啥是定着促进？
s*y
34 楼
啊？从来没有听过这种用法。貌似不行吧，LacI promoter 是细菌promoter.
【在 H*******i 的大作中提到】
: 用LacI/IPTG在真核细胞里有啥问题么？
【在 H*******i 的大作中提到】
: 用LacI/IPTG在真核细胞里有啥问题么？
a*3
35 楼
原来是这样啊，受教了，也就是说定着促进申请者，之前须有日本学术振兴会的特别研
究员经历喽？
【在 F***y 的大作中提到】
: 申请前提是PD后留校任教。其背景是外国人PD结束后，在日本找不到工作，日本政府觉
: 得花了冤枉钱，硬性特意发展定着促进。
: 类似政府给大学免费提供一个PD2年给大学工作，然后大学保证给这个PD一份教职。一
: 旦进入教职，所有费用就是大学来承担。
: 这样需要大学占用一个教职位子，很少有大学愿意申请这个项目，除非是教授想把自己
: 的学生留下，还可以在教授会上一拼。
究员经历喽？
【在 F***y 的大作中提到】
: 申请前提是PD后留校任教。其背景是外国人PD结束后，在日本找不到工作，日本政府觉
: 得花了冤枉钱，硬性特意发展定着促进。
: 类似政府给大学免费提供一个PD2年给大学工作，然后大学保证给这个PD一份教职。一
: 旦进入教职，所有费用就是大学来承担。
: 这样需要大学占用一个教职位子，很少有大学愿意申请这个项目，除非是教授想把自己
: 的学生留下，还可以在教授会上一拼。
H*i
36 楼
随便问问 原核里面的Activator在真核里面不管用是肯定的
不过因为原核里面最常用的LacI/TetR都是repressor，而且都有造成DNA looping的可
能，所以问问。另外Yeast里面Gal1是可以IPTG诱导的吧。
真核里面ptet也是基于TetR吧
不过因为原核里面最常用的LacI/TetR都是repressor，而且都有造成DNA looping的可
能，所以问问。另外Yeast里面Gal1是可以IPTG诱导的吧。
真核里面ptet也是基于TetR吧
I*A
37 楼
这个倒不是必须的
另外，也有不少人做完这个就回国了，倒是不一定留在日本
【在 a**********3 的大作中提到】
: 原来是这样啊，受教了，也就是说定着促进申请者，之前须有日本学术振兴会的特别研
: 究员经历喽？
另外，也有不少人做完这个就回国了，倒是不一定留在日本
【在 a**********3 的大作中提到】
: 原来是这样啊，受教了，也就是说定着促进申请者，之前须有日本学术振兴会的特别研
: 究员经历喽？
a*n
38 楼
他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
stem.
pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
: 点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
: 我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
: 另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
: sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
: 的序列？）
载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
stem.
pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
: 点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
: 我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
: 另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
: sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
: 的序列？）
F*y
39 楼
PD分两种，一种是和往常一样的，24个月以内pd，到期走人，大学没有义务给你安排工
作。
最近又添加了一种定着pd，这个是到期后，留下任教的。
第一种日本政府发现很亏，跑美国读phd的都留下，而来日本的到期找不到工作，留不
住人。
很大原因是日本学术界的师徒关系的特殊性，裙带关系封闭性，外人很难插足进来。
于是文部省官僚做了桌上理论，开发了第二种模式。
也就是说，理论上从申请书上来讲第二种好申请，因为几乎没有大学去申请这个。
这么讲，你能明白吗？
【在 a**********3 的大作中提到】
: 原来是这样啊，受教了，也就是说定着促进申请者，之前须有日本学术振兴会的特别研
: 究员经历喽？
作。
最近又添加了一种定着pd，这个是到期后，留下任教的。
第一种日本政府发现很亏，跑美国读phd的都留下，而来日本的到期找不到工作，留不
住人。
很大原因是日本学术界的师徒关系的特殊性，裙带关系封闭性，外人很难插足进来。
于是文部省官僚做了桌上理论，开发了第二种模式。
也就是说，理论上从申请书上来讲第二种好申请，因为几乎没有大学去申请这个。
这么讲，你能明白吗？
【在 a**********3 的大作中提到】
: 原来是这样啊，受教了，也就是说定着促进申请者，之前须有日本学术振兴会的特别研
: 究员经历喽？
s*y
40 楼
谢谢！
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
: 载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
: 需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
: stem.
: pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
: 接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
: 载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
: 需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
: stem.
: pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
: 接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
a*3
41 楼
谢谢，学习了！我看了学振网页，确实定着申请人少很多，医药齿学类前年才九人申请
，录了四个人，这么算来录取率接近50%。而一般类的医药齿学每年近150人申请，录取
率仅10%左右。
【在 F***y 的大作中提到】
: PD分两种，一种是和往常一样的，24个月以内pd，到期走人，大学没有义务给你安排工
: 作。
: 最近又添加了一种定着pd，这个是到期后，留下任教的。
: 第一种日本政府发现很亏，跑美国读phd的都留下，而来日本的到期找不到工作，留不
: 住人。
: 很大原因是日本学术界的师徒关系的特殊性，裙带关系封闭性，外人很难插足进来。
: 于是文部省官僚做了桌上理论，开发了第二种模式。
: 也就是说，理论上从申请书上来讲第二种好申请，因为几乎没有大学去申请这个。
: 这么讲，你能明白吗？
，录了四个人，这么算来录取率接近50%。而一般类的医药齿学每年近150人申请，录取
率仅10%左右。
【在 F***y 的大作中提到】
: PD分两种，一种是和往常一样的，24个月以内pd，到期走人，大学没有义务给你安排工
: 作。
: 最近又添加了一种定着pd，这个是到期后，留下任教的。
: 第一种日本政府发现很亏，跑美国读phd的都留下，而来日本的到期找不到工作，留不
: 住人。
: 很大原因是日本学术界的师徒关系的特殊性，裙带关系封闭性，外人很难插足进来。
: 于是文部省官僚做了桌上理论，开发了第二种模式。
: 也就是说，理论上从申请书上来讲第二种好申请，因为几乎没有大学去申请这个。
: 这么讲，你能明白吗？
q*7
42 楼
提小RNA可以用这个公司的Kit 或者他们的试剂。可以同时检测mRNA和小RNA的表达水平
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki
http://www.greenbioresearch.com/ribozol-trizol-tri-reagent-me/
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki
http://www.greenbioresearch.com/ribozol-trizol-tri-reagent-me/
I*A
43 楼
仅仅是不上所得税而已，健康保险年金住民税等等等等都不算在内，扣除了这些其实剩
不了多少，另外也没有bonus，比准教授级别差远了。（准教授级别的工资，按厚劳省
2014年的统计，平均值大概是一年840万）。
【在 F***y 的大作中提到】
: 日本的研究申请是有自己严格的写作格式和审查形式的。
: 这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
: 最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
: 而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
: 申请不是你一个人完成的。
: 尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
: 校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
: 而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
不了多少，另外也没有bonus，比准教授级别差远了。（准教授级别的工资，按厚劳省
2014年的统计，平均值大概是一年840万）。
【在 F***y 的大作中提到】
: 日本的研究申请是有自己严格的写作格式和审查形式的。
: 这个形式与欧美的不同，与中国的更不一样。
: 最快的方式是找到有意接收你研究室，在他们的指导下写申请书
: 而且PD申请是和研究室合作项目，到时还要研究室教授提出的项目申请，也就是说这个
: 申请不是你一个人完成的。
: 尽管只有10%的录取率，你要想这10%是来自全球的竞争，什么人都能申请，如果出身学
: 校好，论文数量多，观点新颖，中奖率还是不错的。
: 而且这个PD薪水是不用上税的，算下来比一般日本副教授的薪水都要高。
x*u
44 楼
我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
s*y
45 楼
谢谢！我们的细胞，在我们所需要用的shRNA 成功表达之后也会死。
正是因为这个原因我们需要用荧光蛋白标记而不能用药选。
你用的那个质粒做克隆的时候方便么？那个什么pGIPZ克隆起来老麻烦了。
【在 x****u 的大作中提到】
: 我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
: 效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
: 如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
:
: 到。
正是因为这个原因我们需要用荧光蛋白标记而不能用药选。
你用的那个质粒做克隆的时候方便么？那个什么pGIPZ克隆起来老麻烦了。
【在 x****u 的大作中提到】
: 我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
: 效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
: 如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
:
: 到。
b*8
46 楼
可以用pLenti lox3.7这个载体，自带EGFP，用HpaI—XhoI这两个酶切位点
f*g
47 楼
把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。
c*7
48 楼
tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
s*y
49 楼
谢谢！能不能说说为什么要design 3‘mismatch？ 这个是什么意思啊？
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
s*y
50 楼
这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
么标准啊？）
所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
【在 f******g 的大作中提到】
: 把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。
说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
么标准啊？）
所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
【在 f******g 的大作中提到】
: 把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。
H*i
51 楼
10K多的质粒有时候修改操作起来麻烦点？有的实验室用惯了可能也就习惯了，因为他
们的操作都在另外两个工作质粒上，每次只需要把基因修改在工作质粒上，然后连成这
个载体就行了。。
看图谱EcoRI在HygroR那个位置，只要换个同义突变就行了
们的操作都在另外两个工作质粒上，每次只需要把基因修改在工作质粒上，然后连成这
个载体就行了。。
看图谱EcoRI在HygroR那个位置，只要换个同义突变就行了
H*i
52 楼
另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
如果要用XhoI 和EcoRI
首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
没有XhoI EcoRI MluI
然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
也就多花3天/4天时间。
aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
如果要用XhoI 和EcoRI
首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
没有XhoI EcoRI MluI
然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
也就多花3天/4天时间。
f*g
53 楼
因为open biosystem最开始使用的是pSM2质粒，设计好的shRNA全部克隆到这个载体里
面，后来有了慢病毒lentiviral vector（pGIpz），他们就把原来的psm2的shRNA全部
克隆到新的pgipz上面，另外还有新设计的shRNA。
突变掉另外那个EcorI没有任何影响，我们已经做了。
还有，如果你想转干细胞，至少是造血干，pGIPz不是一个很好的选择，因为他的启动
子是CMV，转干细胞效率极低。如果是普通的细胞系，应该没有问题。原代细胞，我没
有试过。
如果你实在没有好的选择，短信我，我有修饰过的pGIPz载体，很好用。但是要和老板
签署MTA。
cassette
【在 s******y 的大作中提到】
: 这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
: 说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
: Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
: 在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
: 想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
: 么标准啊？）
: 所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
: 容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
面，后来有了慢病毒lentiviral vector（pGIpz），他们就把原来的psm2的shRNA全部
克隆到新的pgipz上面，另外还有新设计的shRNA。
突变掉另外那个EcorI没有任何影响，我们已经做了。
还有，如果你想转干细胞，至少是造血干，pGIPz不是一个很好的选择，因为他的启动
子是CMV，转干细胞效率极低。如果是普通的细胞系，应该没有问题。原代细胞，我没
有试过。
如果你实在没有好的选择，短信我，我有修饰过的pGIPz载体，很好用。但是要和老板
签署MTA。
cassette
【在 s******y 的大作中提到】
: 这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
: 说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
: Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
: 在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
: 想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
: 么标准啊？）
: 所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
: 容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
a*d
54 楼
FUGW-H1 lentiviral vector for shRNA. It has ubiquitin promoter for EGFP and
H1 promoter for shRNA expression.
You can find it on Addgene.
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
H1 promoter for shRNA expression.
You can find it on Addgene.
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
s*y
55 楼
谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都是构建
在pLKO.1-puro上的。
另外，关于对照组，我以前都是用 GFP-shRNA 来做对照，但是这次要同时在细胞里表
达一个GFP fusion protein, 就不方便用这个了。我听说也有人用luciferase来做non-
KO control, 不知道能否麻烦知道的人贴一下序列或者referene?
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都是构建
在pLKO.1-puro上的。
另外，关于对照组，我以前都是用 GFP-shRNA 来做对照，但是这次要同时在细胞里表
达一个GFP fusion protein, 就不方便用这个了。我听说也有人用luciferase来做non-
KO control, 不知道能否麻烦知道的人贴一下序列或者referene?
s*y
56 楼
关于 Tet-inducible shRNA，除了Open Biosystem 的，addgene 上有没有便宜的？
对了，能不能麻烦你多说两句那个design 3‘ mismatch 是什么意思？
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
对了，能不能麻烦你多说两句那个design 3‘ mismatch 是什么意思？
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
S*s
57 楼
addgene plko-tet-ON
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
s*y
58 楼
非常感谢！找到了! 他们改名叫做Tet-pLKO-puro， 因为：
“The name was changed to clarify that this plasmid does not contain and is
not related to the trademarked Tet-On(R) system sold by Clontech. ”
【在 S*********s 的大作中提到】
: addgene plko-tet-ON
“The name was changed to clarify that this plasmid does not contain and is
not related to the trademarked Tet-On(R) system sold by Clontech. ”
【在 S*********s 的大作中提到】
: addgene plko-tet-ON
s*y
59 楼
所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
【在 H*******i 的大作中提到】
: 另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
: aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
: 依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
: 如果要用XhoI 和EcoRI
: 首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
: 没有XhoI EcoRI MluI
: 然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
: 后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
: 也就多花3天/4天时间。
可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
【在 H*******i 的大作中提到】
: 另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
: aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
: 依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
: 如果要用XhoI 和EcoRI
: 首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
: 没有XhoI EcoRI MluI
: 然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
: 后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
: 也就多花3天/4天时间。
f*g
60 楼
用Bamhi会损坏mir30，影响shRNA的表达
另外，plko载体好像没有荧光，至少我们最开始用的那个open biosys没有
【在 s******y 的大作中提到】
: 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
: 可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
: 如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
: 啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
: 不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
: ，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
: 了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
另外，plko载体好像没有荧光，至少我们最开始用的那个open biosys没有
【在 s******y 的大作中提到】
: 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
: 可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
: 如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
: 啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
: 不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
: ，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
: 了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
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