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Flag fusion protein help!

Flag fusion protein help!# Biology - 生物学

l*22013-08-07 07:08

1 楼

我有一个fushion protein, 在plasmid N-terminal有Flag和HA两个tag。我用
lipofectamine LTX&plus转到293T后，用lysate做western blot。能测到我的靶蛋白，
但两个tag都测不到。估计不是抗体的原因，因为用了sigma和stratagene的anti-Flag
ab都不行。求问板上大神，这个可能是什么问题？谢谢！

C*S2013-08-07 07:08

2 楼

膜蛋白？被切掉了？

e*s2013-08-07 07:08

3 楼

要我猜就是
1）灵敏度的问题。
有时候，目标蛋白的抗体灵敏度高很多。多上点样，增加暴光时间或者多加DNA，增加
表达。
2）检测到的目标蛋白是内源的。你的Plasmid并没有表达。

Flag

【在 l*********2 的大作中提到】

: 我有一个fushion protein, 在plasmid N-terminal有Flag和HA两个tag。我用
: lipofectamine LTX&plus转到293T后，用lysate做western blot。能测到我的靶蛋白，
: 但两个tag都测不到。估计不是抗体的原因，因为用了sigma和stratagene的anti-Flag
: ab都不行。求问板上大神，这个可能是什么问题？谢谢！

l*22013-08-07 07:08

4 楼

目标蛋白不是内源的，在293T里不表达。我用六孔板转染的，每孔转了1ug质粒。只能
多上样或者先做immunoprecipitation浓缩后再做western了。谢谢！

【在 e****s 的大作中提到】

: 要我猜就是
: 1）灵敏度的问题。
: 有时候，目标蛋白的抗体灵敏度高很多。多上点样，增加暴光时间或者多加DNA，增加
: 表达。
: 2）检测到的目标蛋白是内源的。你的Plasmid并没有表达。
:
: Flag

l*22013-08-07 07:08

5 楼

不是膜蛋白

【在 C**S 的大作中提到】

: 膜蛋白？被切掉了？

v*a2013-08-07 07:08

6 楼

请教一下先ip浓缩再WB具体是什么原理？对WB无法直接看出overexpression的蛋白我也
这样试过，确实有效果，我自己解释为“放大效应”，但有人一challenge我就讲不清
了。今天正好碰上，沾光请教一下。

【在 l*********2 的大作中提到】

: 目标蛋白不是内源的，在293T里不表达。我用六孔板转染的，每孔转了1ug质粒。只能
: 多上样或者先做immunoprecipitation浓缩后再做western了。谢谢！

e*s2013-08-07 07:08

7 楼

不就是浓缩了？
比如你有500 ul的cell lysate，通常就上10-20 ul （上样2%-4%）。IP后，你一般也
就是30-50 ul样品，你再上个10ul (那就是20%-30%)了。

【在 v***a 的大作中提到】

: 请教一下先ip浓缩再WB具体是什么原理？对WB无法直接看出overexpression的蛋白我也
: 这样试过，确实有效果，我自己解释为“放大效应”，但有人一challenge我就讲不清
: 了。今天正好碰上，沾光请教一下。

s*c2013-08-07 07:08

8 楼

FLAG tag可能比较tricky，一些FLAG antibody可能只能识别N-terminus exposed FLAG
tag，还有一些是Calcium dependent，你看你用的抗体和你的FLAG tag是不是
compatible。

l*a2013-08-07 07:08

9 楼

negative control: no transfection, no target protein detected. 证明没有內源
蛋白，
positive control: any other flag tagged protein, 证明抗体ok，
最后是同一个质粒，把gfp放进去检测，以证明你的质粒系统没问题，抗体没问题
这些都做了，估计就是protease cleavage了，我觉得不会切得那么彻底，cell lysate
加protease inhibitor了吗？

【在 l*********2 的大作中提到】

: 目标蛋白不是内源的，在293T里不表达。我用六孔板转染的，每孔转了1ug质粒。只能
: 多上样或者先做immunoprecipitation浓缩后再做western了。谢谢！

l*a2013-08-07 07:08

10 楼

。。。。。。
不就是浓缩吗？

【在 v***a 的大作中提到】

l*22013-08-07 07:08

11 楼

negative control已经做了，的确是没有内源表达。
订了sigma的control protein，准备做positive control证明抗体ok。
我用了thermo的protease inhibitor。只能再试试了。谢谢！

lysate

【在 l******a 的大作中提到】

: negative control: no transfection, no target protein detected. 证明没有內源
: 蛋白，
: positive control: any other flag tagged protein, 证明抗体ok，
: 最后是同一个质粒，把gfp放进去检测，以证明你的质粒系统没问题，抗体没问题
: 这些都做了，估计就是protease cleavage了，我觉得不会切得那么彻底，cell lysate
: 加protease inhibitor了吗？

v*a2013-08-07 07:08

12 楼

谢谢！

【在 e****s 的大作中提到】

: 不就是浓缩了？
: 比如你有500 ul的cell lysate，通常就上10-20 ul （上样2%-4%）。IP后，你一般也
: 就是30-50 ul样品，你再上个10ul (那就是20%-30%)了。

C*S2013-08-07 07:08

13 楼

一个是浓缩，另一方面也是纯化了。没有杂蛋白干扰，目的蛋白就容易检测到了。

【在 e****s 的大作中提到】

: 不就是浓缩了？
: 比如你有500 ul的cell lysate，通常就上10-20 ul （上样2%-4%）。IP后，你一般也
: 就是30-50 ul样品，你再上个10ul (那就是20%-30%)了。