a*2
2 楼
用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！
f*d
3 楼
别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
a*2
4 楼
可我用它们两年了，一堆stable transfected的cell line，每个select都要花一两个
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
s*s
5 楼
1.其他细胞有问题么？
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
a*2
6 楼
谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
A*y
7 楼
Probably your trypsin?
a*2
8 楼
用过新开封的trypsin，好像无关。。。
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
m*3
9 楼
I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
s*s
10 楼
293没这么脆弱
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
D*s
11 楼
哈哈，感觉被人投毒了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
d*t
12 楼
这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
d*t
13 楼
你试了几管都这样么？
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
T*u
14 楼
支原体。
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
C*2
15 楼
something is wrong with your DMSO.
s*r
16 楼
293我都懒得放液氮罐里，扔-80度一年多了化开还都长的好好的
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
y*y
17 楼
在别的细胞上出过同样问题
花了一个多月快把冻的细胞用光了最后发现是血清的原因
FBS光换新的不行要换lot
后来要了几个lot的样品找到合适的买了一批自己专用的之后就没出过问题了
花了一个多月快把冻的细胞用光了最后发现是血清的原因
FBS光换新的不行要换lot
后来要了几个lot的样品找到合适的买了一批自己专用的之后就没出过问题了
j*9
18 楼
我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的
A*y
19 楼
Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line.
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
a*2
20 楼
谢谢楼上各位的comments!
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？
V*t
21 楼
楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
b*g
22 楼
会不会被 retrovirus 污染了？
s*s
23 楼
293就是这样的，很容易不爽。不过一般不爽就是产病毒效率低，
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
a*2
24 楼
用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！
f*d
25 楼
别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
a*2
26 楼
可我用它们两年了，一堆stable transfected的cell line，每个select都要花一两个
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
s*s
27 楼
1.其他细胞有问题么？
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
a*2
28 楼
谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
A*y
29 楼
Probably your trypsin?
a*2
30 楼
用过新开封的trypsin，好像无关。。。
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
m*3
31 楼
I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
s*s
32 楼
293没这么脆弱
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
D*s
33 楼
哈哈，感觉被人投毒了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
d*t
34 楼
这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
d*t
35 楼
你试了几管都这样么？
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
T*u
36 楼
支原体。
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
C*2
37 楼
something is wrong with your DMSO.
s*r
38 楼
293我都懒得放液氮罐里，扔-80度一年多了化开还都长的好好的
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
j*9
39 楼
我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的
A*y
40 楼
Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line.
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
a*2
41 楼
谢谢楼上各位的comments!
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？
V*t
42 楼
楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
b*g
43 楼
会不会被 retrovirus 污染了？
s*s
44 楼
293就是这样的，很容易不爽。不过一般不爽就是产病毒效率低，
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
r*k
45 楼
我也碰到了一些问题 复苏的再passage 就不行了 总是还没长满就开始 变成
multilayer！ 好烦呀！
multilayer！ 好烦呀！
r*a
46 楼
可能是培养瓶或者皿的问题。我遇到过。
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