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CHIP-QPCR to estimate purification yield?

CHIP-QPCR to estimate purification yield?# Biology - 生物学

f*w2014-06-23 07:06

1 楼

To ensure compliance with federal law, Amazon Payments accountholders are
required to provide a Tax Identification Number. You must provide this
information before Monday, December 31st, 2012 to ensure your account
activity is not interrupted.
我给了他ssn的话岂不是ap都算收入了

n*o2014-06-23 07:06

2 楼

请问比如说agent同意给1%rebate，这个rebate是包括closing cost，还是after
closing cost。我知道这个是case by case, 但想知道大部分人都做法，谢谢。

n*62014-06-23 07:06

3 楼

【以下文字转载自 History 讨论区】
发信人: cxc (宁鸣而死不默而生), 信区: History
标题: 一塌糊涂竟然重新开张了。。。。 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Mar 27 10:56:28 2011, 美东)
发信人: xiaopanghou (xiaopanghou), 信区: Fishing
标题: 一塌糊涂竟然重新开张了。。。。
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 26 19:08:41 2011, 美东)
拿了n年前的账户密码竟然登陆上去了。然后惊诧的发现自己是长老级了。。。。

g*32014-06-23 07:06

4 楼

Hi All,
Recently I am doing CHIP-QPCR to test one TF binding. I use 10% of sample as
Input and the rest 90% to do IP. I have the TF-positive cell line A and TF-
depleted cell line B.
Primer is flanking the targeting site of TF.
The result I have is:
In A: Ct in IP 26 & Ct in Input 20 [Ct difference is 4]
In B: Ct in IP 30 & Ct in Input 20. [Ct difference is 10]
It seems TF binds to the targeting site.
However, I followed the calculation process of other people to estimate
yield:
1/9*1/(2^6)
which is extremely low.
I am wondering if anybody has some idea about this: is it reasonable to do
calculation like this? what is the average yield you get?
Thanks.

g*n2014-06-23 07:06

5 楼

给呗
反正到不了要交税的金额吧

w*c2014-06-23 07:06

6 楼

如果agent替你付closing cost，当然是包括啊，不可能帮你付closing cost再给你1％。
除非开始就说好

【在 n****o 的大作中提到】

: 请问比如说agent同意给1%rebate，这个rebate是包括closing cost，还是after
: closing cost。我知道这个是case by case, 但想知道大部分人都做法，谢谢。

s*u2014-06-23 07:06

7 楼

真的俄
我的也上去了。。。

【在 n******6 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 History 讨论区】
: 发信人: cxc (宁鸣而死不默而生), 信区: History
: 标题: 一塌糊涂竟然重新开张了。。。。 (转载)
: 发信站: BBS 未名空间站 (Sun Mar 27 10:56:28 2011, 美东)
: 发信人: xiaopanghou (xiaopanghou), 信区: Fishing
: 标题: 一塌糊涂竟然重新开张了。。。。
: 发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 26 19:08:41 2011, 美东)
: 拿了n年前的账户密码竟然登陆上去了。然后惊诧的发现自己是长老级了。。。。

g*32014-06-23 07:06

8 楼

自己顶一下吧希望有懂的朋友指点下。

f*w2014-06-23 07:06

9 楼

一个月1k的话，怎么可能不交税呢

【在 g**n 的大作中提到】

: 给呗
: 反正到不了要交税的金额吧

n*o2014-06-23 07:06

10 楼

哦，谢谢回答。我本来也是这么认为的，可一个朋友确实是另一种情况。然后就有点疑
惑了。

q*x2014-06-23 07:06

11 楼

靠，
都忘了我的帐号了

t*l2014-06-23 07:06

12 楼

我也在自己做CHIP
我感觉你的INPUT太多了。你说你的SAMPLE A 的CT diff is 4. 明明是6。
不知道你是不是抄错了，然后你按6算的？

s*c2014-06-23 07:06

13 楼

一年20k才交税

【在 f*******w 的大作中提到】

: 一个月1k的话，怎么可能不交税呢

g*a2014-06-23 07:06

14 楼

我们家是除了closing cost，又额外给了1%的。

【在 n****o 的大作中提到】

: 哦，谢谢回答。我本来也是这么认为的，可一个朋友确实是另一种情况。然后就有点疑
: 惑了。

t*l2014-06-23 07:06

15 楼

我的建议是下次用2%或者5%的input。
做TF的CHIP本身就是很难。你的TFbinding确实很低，所以你需要做一个IgG control,
或者NO AB CONTROL。
还有你现在这种比较方法不是很科学，因为你在比较2个SAMPLE出来的DNA。每个
SAMPLE 的handling都会造成很大的误差，所以你需要normalize到一个control DNA
region.
1/9*1/(2^6)
which is extremely low.
这个数值你现在show的其实没有任何意义，你这个数值如果跟SAMPLE B比较，其实很高
，但是不能证明这个TF就bind这个地方。
你需要screen其他的region在SAMPLE A里面, 如果你其他的region出来的都是1/9*1/(2
^6) 这个值，那么说明你这个值没有任何意义。
CHIP绝对值的YIELD比较没有什么意义，不同人做CHIP的方法不同，你可以用histone
H3 antibody做个CHIP，看看yield。
最完美的CHIP是这种
有IGG control,有KO CELL LINE control, 有different region control。
IGG control在different region表达都很低。
KO CELL LINE 出来的CHIP和IGG control的YIELD很接近，而且在每个region都接近。
positive control cell line出来的CHIP，只在特定的一个region出现很高的yield，
但是在其他的region,yield和KO 还有IGG control相当。
最后用chip/input%的方式来表达，不要任何的normalization. 这是最完美的CHIP
FIGURE。

c*22014-06-23 07:06

16 楼

我今天也收到邮件了，不过还说了：To be an Amazon Payments accountholder, you
must be a permanent U.S. resident or U.S. citizen. 其实我开了账户也几乎没用
过，是不是关了也就罢了

【在 f*******w 的大作中提到】

: To ensure compliance with federal law, Amazon Payments accountholders are
: required to provide a Tax Identification Number. You must provide this
: information before Monday, December 31st, 2012 to ensure your account
: activity is not interrupted.
: 我给了他ssn的话岂不是ap都算收入了

g*32014-06-23 07:06

17 楼

谢谢toll的回答。不好意思，我有一个typo，已经改正过来了。Ct difference in
sample is 6.
嗯，Input确实可以用1%来做，不过在QPCR之前，我测了浓度，也做了QPCR dilution
test，所以这个应该不是问题。
你提的建议很好，我其实也做了negative primer qpcr,做出来的Ct是NA，说明CHIP结
果的特异性还是不错的。
我说的control就是你提到的KO cell line.
"最后用chip/input%的方式来表达，不要任何的normalization"
这其实也是我最感兴趣的信息，我查了几篇paper，发现别人用HA tag做的CHIP，yield
也很低，大概只能pull down 2%左右的DNA （方法也是通过比较Input和Sample这个某
个特定region的QPCR ct）。
我知道IP nuclear protein效率大概是10-20%或者更低点，但没想到DNA的效率这么低
。还是我实验出了问题，
请问有什么步骤是需要优化的吗？
谢谢toll和各位。

【在 t**l 的大作中提到】

: 我的建议是下次用2%或者5%的input。
: 做TF的CHIP本身就是很难。你的TFbinding确实很低，所以你需要做一个IgG control,
: 或者NO AB CONTROL。
: 还有你现在这种比较方法不是很科学，因为你在比较2个SAMPLE出来的DNA。每个
: SAMPLE 的handling都会造成很大的误差，所以你需要normalize到一个control DNA
: region.
: 1/9*1/(2^6)
: which is extremely low.
: 这个数值你现在show的其实没有任何意义，你这个数值如果跟SAMPLE B比较，其实很高
: ，但是不能证明这个TF就bind这个地方。

c*s2014-06-23 07:06

18 楼

Form 1099-K to report unadjusted annual gross sales or payment volume
information for customers that meet both of the following thresholds in a
calendar year:
•More than $20,000 in gross payment volume, and
•More than 200 transactions.

you

【在 c******2 的大作中提到】

: 我今天也收到邮件了，不过还说了：To be an Amazon Payments accountholder, you
: must be a permanent U.S. resident or U.S. citizen. 其实我开了账户也几乎没用
: 过，是不是关了也就罢了

t*l2014-06-23 07:06

19 楼

如果你真觉得yield太低，试试用同样的方法做histone H3 的CHIP。如果连HISTONE
CHIP都低，那么就是你自己CHIP的问题。yield低有可能也是抗体和cell 本身的问题，
比如做实验的时间，需要一些cytokine pre-treatment之类,也学你的TF只有在某个特
定的signaling pathway激活的2个小时候才bind DNA，或者就是你的抗体不好。

c*22014-06-23 07:06

20 楼

嗯，我开了有一年了吧，就老公给我转了一块钱试了一下，然后就放在那了

【在 c******s 的大作中提到】

: Form 1099-K to report unadjusted annual gross sales or payment volume
: information for customers that meet both of the following thresholds in a
: calendar year:
: •More than $20,000 in gross payment volume, and
: •More than 200 transactions.
:
: you

a*12014-06-23 07:06

21 楼

这个20000的门槛难道是和amazon seller的加到一起算吗？

c*s2014-06-23 07:06

22 楼

我觉得是的, 那为神医给验证一下?

【在 a**********1 的大作中提到】

: 这个20000的门槛难道是和amazon seller的加到一起算吗？

c*72014-06-23 07:06

23 楼

should be.
Paypal has similar requirement.

【在 a**********1 的大作中提到】

: 这个20000的门槛难道是和amazon seller的加到一起算吗？

g*n2014-06-23 07:06

24 楼

是

【在 a**********1 的大作中提到】

: 这个20000的门槛难道是和amazon seller的加到一起算吗？