T*e
2 楼
你想知道什么样的蛋白结合? sequence specific transcription factor? 还是别的?
你想用什么办法检测?in silico? 还是具体的实验?
这个问题太泛泛了吧
你想用什么办法检测?in silico? 还是具体的实验?
这个问题太泛泛了吧
D*A
3 楼
这种sequence specific DNA chromatography不容易做,会有很多杂蛋白粘在上面。
T*e
9 楼
有几种办法:
1. in silico预测,我不知道你对这个基因了解多少,但你如果大概有点概念的话,几
个常见的信号通路你可以测试一下,筛一筛,运气好的话发现点什么,然后顺着这个信
号通路往下走,可能有几个转录因子,你就可以直接找它的
binding site了,然后你回来用实验验证:westernblot, immunostaining, q-PCR
, in situ hybridization等等
还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库,你也可以直接先找找看有没
有binding峰嘛
2. 构建reporter直接进行筛选,luciferase或荧光reporter都行,这个可以向1一样有
针对性的筛,也可以大规模的盲筛
3. yeast one hybridization 这个要看运气了
不知道大家有没有什么更好的办法,欢迎一起探讨
1. in silico预测,我不知道你对这个基因了解多少,但你如果大概有点概念的话,几
个常见的信号通路你可以测试一下,筛一筛,运气好的话发现点什么,然后顺着这个信
号通路往下走,可能有几个转录因子,你就可以直接找它的
binding site了,然后你回来用实验验证:westernblot, immunostaining, q-PCR
, in situ hybridization等等
还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库,你也可以直接先找找看有没
有binding峰嘛
2. 构建reporter直接进行筛选,luciferase或荧光reporter都行,这个可以向1一样有
针对性的筛,也可以大规模的盲筛
3. yeast one hybridization 这个要看运气了
不知道大家有没有什么更好的办法,欢迎一起探讨
r*e
10 楼
这其实是个很重要的基本问题。
楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
。表示有点惊讶。
我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
in silico的我个人觉得特别不靠谱。。。有很多类似的预测网站。。不靠谱。
总之,基于protein找DNA, 相对于基于DNA找protein应该容易的多?
【在 T*****e 的大作中提到】
: 有几种办法:
: 1. in silico预测,我不知道你对这个基因了解多少,但你如果大概有点概念的话,几
: 个常见的信号通路你可以测试一下,筛一筛,运气好的话发现点什么,然后顺着这个信
: 号通路往下走,可能有几个转录因子,你就可以直接找它的
: binding site了,然后你回来用实验验证:westernblot, immunostaining, q-PCR
: , in situ hybridization等等
: 还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库,你也可以直接先找找看有没
: 有binding峰嘛
: 2. 构建reporter直接进行筛选,luciferase或荧光reporter都行,这个可以向1一样有
: 针对性的筛,也可以大规模的盲筛
楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
。表示有点惊讶。
我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
in silico的我个人觉得特别不靠谱。。。有很多类似的预测网站。。不靠谱。
总之,基于protein找DNA, 相对于基于DNA找protein应该容易的多?
【在 T*****e 的大作中提到】
: 有几种办法:
: 1. in silico预测,我不知道你对这个基因了解多少,但你如果大概有点概念的话,几
: 个常见的信号通路你可以测试一下,筛一筛,运气好的话发现点什么,然后顺着这个信
: 号通路往下走,可能有几个转录因子,你就可以直接找它的
: binding site了,然后你回来用实验验证:westernblot, immunostaining, q-PCR
: , in situ hybridization等等
: 还有如果你那个细胞、组织已经有现成的chip-seq数据库,你也可以直接先找找看有没
: 有binding峰嘛
: 2. 构建reporter直接进行筛选,luciferase或荧光reporter都行,这个可以向1一样有
: 针对性的筛,也可以大规模的盲筛
D*A
11 楼
实验室有人在做 的确是上千个蛋白
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
: 但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
: 但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
D*A
12 楼
实验室有人在做 的确是上千个蛋白
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
: 但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
ENCODE
学/
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这其实是个很重要的基本问题。
: 楼上有人说pull down sequence-bound protein然后上mass spec可以打出上千个蛋白
: 。表示有点惊讶。
: 我觉得第一步你可以去参考ENCODE project里的数据(ucsc browser里就有),一般
: promoter区域都有NNN多的transcription factor binding,所以我估计你通过ENCODE
: 就可以找到很多有效信息。结合你研究的生物学pathway估计你也应该知道重要的TF,如
: 果能在ENCODE数据里看到那就非常promising。但注意,所有的epigenome的调控都是非
: 常tissue-specific的。ENCODE提供了大概9种cell line,很多时候具体到你的生物学/
: 医学问题,这9种cell line是完全不能说明问题的(尤其对于神经组织)
: 但anyway你是promoter区域,希望大大的有,比其他的noncoding区域容易做的多了。
P*F
15 楼
谢谢楼上各位的建议和讨论!
我的设想如下:
1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
)处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
反应的DNA序列。
2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
进一步增强报告基因的活性。
3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
不知大家对此设想有何高见?
【在 k****l 的大作中提到】
: yeast one hybrid 筛选
我的设想如下:
1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
)处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
反应的DNA序列。
2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
进一步增强报告基因的活性。
3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
不知大家对此设想有何高见?
【在 k****l 的大作中提到】
: yeast one hybrid 筛选
H*s
16 楼
这是个非常有趣但是很难回答的问题,因为未知因素或者说是不确定因素太多。比如说
,你的启动子有多大?学界对这个启动子的了解程度如何?有没有一些突变可以改变启
动子活性?根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
优点、缺点和局限性。考虑周全,路可以走得顺一些。举个例子,就酵母单杂交来说,
假设你不需要从头学起,假阳性也很高,后期的确认也非常花时间,并且不是所有的启
动子都可以放进这个系统的。
另外,可能话有点多,你是还在读学位的学生吗?如果是的话,对于你上面的研究计划
,我会说,去干吧,孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣,何况你还在
training之中。如果你处于博士后研究阶段,我会说,看看有没有什么比较成熟的技术
可以使用,或者是看看花点钱找个CRO给做了,因为你所处职业发展的阶段不太适合从
头开始建系统,那是出力不讨好的事情。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论!
: 我的设想如下:
: 1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
: 把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
: )处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
: 特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
,你的启动子有多大?学界对这个启动子的了解程度如何?有没有一些突变可以改变启
动子活性?根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
优点、缺点和局限性。考虑周全,路可以走得顺一些。举个例子,就酵母单杂交来说,
假设你不需要从头学起,假阳性也很高,后期的确认也非常花时间,并且不是所有的启
动子都可以放进这个系统的。
另外,可能话有点多,你是还在读学位的学生吗?如果是的话,对于你上面的研究计划
,我会说,去干吧,孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣,何况你还在
training之中。如果你处于博士后研究阶段,我会说,看看有没有什么比较成熟的技术
可以使用,或者是看看花点钱找个CRO给做了,因为你所处职业发展的阶段不太适合从
头开始建系统,那是出力不讨好的事情。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论!
: 我的设想如下:
: 1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
: 把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
: )处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
: 特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
T*e
17 楼
这个已经有人做了。希望我能找到看过的那篇文献。
你的设计概念上很好,但有几个小问题:
1. 为什么要用某种化学物质处理呢?你想要模拟某个细胞信号?或者单纯想找出一种
inducible的转录结合/诱导?你大概是想后者。我个人认为与其泛泛的筛选,不如根据
某个具体的发育/疾病环境进行筛选。
2.最后找到的目的是什么呢?即使你说你这个筛选的模式是全新的系统(姑且不论已经
有类似的文章发表了),你能直接找到的蛋白/DNA结合仍然是那个细胞体系/环境下固
有的。如果你不进一步优化这个蛋白的话,我很难想象如何推广这种应用。
一点浅见。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论!
: 我的设想如下:
: 1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
: 把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
: )处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
: 特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
你的设计概念上很好,但有几个小问题:
1. 为什么要用某种化学物质处理呢?你想要模拟某个细胞信号?或者单纯想找出一种
inducible的转录结合/诱导?你大概是想后者。我个人认为与其泛泛的筛选,不如根据
某个具体的发育/疾病环境进行筛选。
2.最后找到的目的是什么呢?即使你说你这个筛选的模式是全新的系统(姑且不论已经
有类似的文章发表了),你能直接找到的蛋白/DNA结合仍然是那个细胞体系/环境下固
有的。如果你不进一步优化这个蛋白的话,我很难想象如何推广这种应用。
一点浅见。
inducer
【在 P**F 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的建议和讨论!
: 我的设想如下:
: 1. 用已有的启动子(较弱)驱动一个报告基因,然后在此基础上构建一个library,
: 把random序列(6~8 bp ?)放在这个较弱启动子的前面并用某种化学物质(inducer
: )处理,然后在in vivo筛选报告基因表达增强的克隆。目的是找到对此inducer有特异
: 反应的DNA序列。
: 2. 根据此DNA序列,寻找能够在体内情况下结合的蛋白,然后通过调节这些蛋白的表达
: 进一步增强报告基因的活性。
: 3. 最终目的是建立一个全新的系统,包括synthetic promoter和上游调控因子,能对
: 特殊的inducer(可以是任何环境影响,不限于化合物)具有超灵敏的反应。
P*F
18 楼
非常感谢你的诚恳建议!
我也考虑过酵母单杂交,但这个系统的问题一是这个库是否足够大,另一个是担心酵母
系统跟我做的物种太不相同。何况有的时候这种调控并不能由单一蛋白完成。
对我现在的启动子,学术界已经研究超过20年了,可以说很清楚了。我之所以选这个启
动子,其实主要是利用它来筛选我感兴趣的DNA短序列以及相应的调控机制,并不在现
有启动子本身。我知道这肯定会花很多时间跟精力,但是现在只是想了解一下有多大可
行性,也想在有限的时间内做些预备性的实验,为将来自己的方向打基础。
【在 H****s 的大作中提到】
: 这是个非常有趣但是很难回答的问题,因为未知因素或者说是不确定因素太多。比如说
: ,你的启动子有多大?学界对这个启动子的了解程度如何?有没有一些突变可以改变启
: 动子活性?根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
: 优点、缺点和局限性。考虑周全,路可以走得顺一些。举个例子,就酵母单杂交来说,
: 假设你不需要从头学起,假阳性也很高,后期的确认也非常花时间,并且不是所有的启
: 动子都可以放进这个系统的。
: 另外,可能话有点多,你是还在读学位的学生吗?如果是的话,对于你上面的研究计划
: ,我会说,去干吧,孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣,何况你还在
: training之中。如果你处于博士后研究阶段,我会说,看看有没有什么比较成熟的技术
: 可以使用,或者是看看花点钱找个CRO给做了,因为你所处职业发展的阶段不太适合从
我也考虑过酵母单杂交,但这个系统的问题一是这个库是否足够大,另一个是担心酵母
系统跟我做的物种太不相同。何况有的时候这种调控并不能由单一蛋白完成。
对我现在的启动子,学术界已经研究超过20年了,可以说很清楚了。我之所以选这个启
动子,其实主要是利用它来筛选我感兴趣的DNA短序列以及相应的调控机制,并不在现
有启动子本身。我知道这肯定会花很多时间跟精力,但是现在只是想了解一下有多大可
行性,也想在有限的时间内做些预备性的实验,为将来自己的方向打基础。
【在 H****s 的大作中提到】
: 这是个非常有趣但是很难回答的问题,因为未知因素或者说是不确定因素太多。比如说
: ,你的启动子有多大?学界对这个启动子的了解程度如何?有没有一些突变可以改变启
: 动子活性?根据这些信息你可以更进一步地来考虑你要做的事情。每一种技术都有它的
: 优点、缺点和局限性。考虑周全,路可以走得顺一些。举个例子,就酵母单杂交来说,
: 假设你不需要从头学起,假阳性也很高,后期的确认也非常花时间,并且不是所有的启
: 动子都可以放进这个系统的。
: 另外,可能话有点多,你是还在读学位的学生吗?如果是的话,对于你上面的研究计划
: ,我会说,去干吧,孩子。因为探索未知的乐趣远远大于解决问题的乐趣,何况你还在
: training之中。如果你处于博士后研究阶段,我会说,看看有没有什么比较成熟的技术
: 可以使用,或者是看看花点钱找个CRO给做了,因为你所处职业发展的阶段不太适合从
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