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也问一个knockout小鼠的问题

也问一个knockout小鼠的问题# Biology - 生物学

l*32014-10-25 07:10

1 楼

做的是knockout-first的ko鼠，neo基因有独立的promoter
Mutant的序列大致是：FRT-lacZ-loxp1-neo-FRT-loxp2-exon-loxp3
现在拿到老鼠后是不是必须先和flp鼠交配去掉FRT之间那一大段序列？可是实验室之前
的人当作conditional KO鼠直接和cre的鼠交配了。我现在已经拿到ko小鼠开始做实验
了，突然发现前面那段序列没去掉，到底会不会有影响呢？可以继续作实验吗？还是必
须再重新折腾半年？
请大家帮忙看看，谢谢啦

H*N2014-10-25 07:10

2 楼

The purpose of conditional ko is to delete the gene at the desired place and
time and to avoid embryonic lethality. Your mice is KO first, meaning it is
KO already if you don't delete the LacZ cassette; crossing with Cre is
meaningless. If KO of your gene is not embryonicaly lethal, you don't have
to cross it to Cre. If it is, you then have to delete the LacZ first, then
cross with Cre.

s*i2014-10-25 07:10

3 楼

some times knockout first may have leakage, and still result in GOI
expression.
Breeding with Cre makes it is a real knockout.
FRT makes it conditional.

and
is

【在 H****N 的大作中提到】

: The purpose of conditional ko is to delete the gene at the desired place and
: time and to avoid embryonic lethality. Your mice is KO first, meaning it is
: KO already if you don't delete the LacZ cassette; crossing with Cre is
: meaningless. If KO of your gene is not embryonicaly lethal, you don't have
: to cross it to Cre. If it is, you then have to delete the LacZ first, then
: cross with Cre.

H*N2014-10-25 07:10

4 楼

I was just answering LZ's question in general terms. If you want to talk
specific.cases, we can spend a lot of time on this, hypomorphic, cre-
specificity, cre efficiency, etc. We don't know what LZ's gene is like, but
if you want to do cko, do it the right way.

【在 s*****i 的大作中提到】

: some times knockout first may have leakage, and still result in GOI
: expression.
: Breeding with Cre makes it is a real knockout.
: FRT makes it conditional.
:
: and
: is

t*k2014-10-25 07:10

5 楼

理论上用KO老鼠做实验需要用fl/fl的litter mates做control. 不用FRT切的话，你的
control老鼠就依然是KO fist，而不是fl/fl的老鼠。这样你做实验就成了whole body
KO vs conditional KO了。

【在 l******3 的大作中提到】

: 做的是knockout-first的ko鼠，neo基因有独立的promoter
: Mutant的序列大致是：FRT-lacZ-loxp1-neo-FRT-loxp2-exon-loxp3
: 现在拿到老鼠后是不是必须先和flp鼠交配去掉FRT之间那一大段序列？可是实验室之前
: 的人当作conditional KO鼠直接和cre的鼠交配了。我现在已经拿到ko小鼠开始做实验
: 了，突然发现前面那段序列没去掉，到底会不会有影响呢？可以继续作实验吗？还是必
: 须再重新折腾半年？
: 请大家帮忙看看，谢谢啦

g*52014-10-25 07:10

6 楼

sound like EUCOM plasmid

s*i2014-10-25 07:10

7 楼

eucom和komp都有一系列这类质粒，他们是共享的。构建的很巧妙

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 g*********5 的大作中提到】

: sound like EUCOM plasmid

w*a2014-10-25 07:10

8 楼

首先，我不是回答你这个问题最权威的人员，你可以参考http://www.creative-animodel.com/Animal-Model-Development/Knockout-Services 获取knockout mouse的最具体的信息。

w*j2014-10-25 07:10

9 楼

同求教！我也有一个这样的老鼠，也是和楼主一样直接给cre杂交了
以前我也问过就是EUCOM的老鼠
但这里没一个人给过确切答复
FRT-lacZ-loxp1-neo-FRT-loxp2-exon-loxp3
这所谓的KO first老鼠并没有发生基因缺失啊？为何说有leakage？
和Cre杂交后exon被deleted后才有基因缺失啊

【在 s*****i 的大作中提到】

: some times knockout first may have leakage, and still result in GOI
: expression.
: Breeding with Cre makes it is a real knockout.
: FRT makes it conditional.
:
: and
: is

D*a2014-10-25 07:10

10 楼

已经有很多人都发现他们带着neo的老鼠本身就造成了allele的表达受影响了。包括我
们以前用的。wt和有neo的蛋白量差很多，表型也有影响。可能是因为rna长度变了影响
了剪切。
FRT的影响不知道。
不知道啥叫leakage。
你要真想知道，就自己跑个蛋白看看。不过这种报道出来的都好几个了。

【在 w***j 的大作中提到】

:
: 同求教！我也有一个这样的老鼠，也是和楼主一样直接给cre杂交了
: 以前我也问过就是EUCOM的老鼠
: 但这里没一个人给过确切答复
: FRT-lacZ-loxp1-neo-FRT-loxp2-exon-loxp3
: 这所谓的KO first老鼠并没有发生基因缺失啊？为何说有leakage？
: 和Cre杂交后exon被deleted后才有基因缺失啊

q*i2014-10-25 07:10

11 楼

你的老鼠拿到手就是whole body Het，因为在exon前面插入了几千bp的片段，干扰了
target gene的表达，如果你直接breed het to het，理论上可以得到 whole body KO
，当然你需要检测protein level以确认。如果你想要得到conditional KO, 就必须先
和flp的老鼠交配，去掉两个FRT之间的部分，得到的就是一个正常的flox老鼠，这时候
再和不同的cre交配就可以得到conditional KO。这种方法可以更快的得到whole body
KO，因为给你的就相当于Het了。

【在 l******3 的大作中提到】

l*e2014-10-25 07:10

12 楼

google "gene trap"
I'm pretty sure that the insert contains a splicing acceptor site followed
by STOP codons. This would promote upstream exon to be spliced into the
insert, instead of the downstream exons. Thus, the mutant transcript would
contain multiple STOP codons that prevent translation of downstream mRNA
sequences.
Leakage happens when normal splicing occurs at low frequency, even in the
presence of the inserted splicing acceptor site.
Hope it helps.

【在 w***j 的大作中提到】

F*p2014-10-25 07:10

13 楼

前面人用什么cre line做的cross? 这个对你现在的实验很重要，要搞清楚。
Frt需要去除，否则很可能影响phenotype.
Eucom的vector是设计来一clone 多用途的，可以研究promoter, 可以conditional
knockout, 有的还来翻转过来做rescue. 根据你的project 在cell line的时候先决定
要不要frt, 否则全弄到老鼠里有的时候反倒很麻烦。

【在 l******3 的大作中提到】