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如何改进 Genomic DNA的PCR

如何改进 Genomic DNA的PCR# Biology - 生物学

c*e2014-12-23 08:12

1 楼

之前听说TSC要容易，但是最近似乎看到板上很多人都说太多人efile到TSC去了，导致
他们处理时间比NSC要长很多。但是现在大家还有看到TSC有比NSC容易通过的趋势么？
我再NSC的辖区，但是公司说TSC容易过，非得帮我efile去TSC。我不知道会不会现在既
不容易过，处理时间还长。。。。那不是得不偿失:(
有谁能给点hint啊。。。。

y*02014-12-23 08:12

2 楼

最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！

k*g2014-12-23 08:12

3 楼

No PP, No TSC

【在 c****e 的大作中提到】

: 之前听说TSC要容易，但是最近似乎看到板上很多人都说太多人efile到TSC去了，导致
: 他们处理时间比NSC要长很多。但是现在大家还有看到TSC有比NSC容易通过的趋势么？
: 我再NSC的辖区，但是公司说TSC容易过，非得帮我efile去TSC。我不知道会不会现在既
: 不容易过，处理时间还长。。。。那不是得不偿失:(
: 有谁能给点hint啊。。。。

s*y2014-12-23 08:12

4 楼

直接quit了算了
还有比做PCR更简单的活儿吗？

【在 y*****0 的大作中提到】

: 最近在做genomic DNA的PCR，用的Tm 60Co, Herculase2 DNA polymerase
: 40uL PCR reaction，全是文章里的条件。但做出来的band总是模模糊糊的，不sharp。
: 不知道有什么办法可以改进这个PCR？万分感谢！

c*e2014-12-23 08:12

5 楼

晕死，看来得说服公司不往TSC efile啊。。。。nnd

【在 k**********g 的大作中提到】

: No PP, No TSC

i*l2014-12-23 08:12

6 楼

同意，这也看天赋的。你这么问，的确显示的很不具PCR天赋.

【在 s******y 的大作中提到】

: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗？

x*32014-12-23 08:12

7 楼

人家说的意思是如果你不pp，你弄不到tsc
tsc还是容易过的

【在 c****e 的大作中提到】

: 晕死，看来得说服公司不往TSC efile啊。。。。nnd

s*y2014-12-23 08:12

8 楼

做个烂PCR也跟天赋扯上了，提质粒是不是也是天赋啊，廓狐还是kit提哦
难怪人说学生物的笨

【在 i***l 的大作中提到】

: 同意，这也看天赋的。你这么问，的确显示的很不具PCR天赋.

c*e2014-12-23 08:12

9 楼

为啥我公司的律师跟我说，他们会帮我efile到tsc，但是不pp？

【在 x****3 的大作中提到】

: 人家说的意思是如果你不pp，你弄不到tsc
: tsc还是容易过的

i*l2014-12-23 08:12

10 楼

呵呵
随便

【在 s******y 的大作中提到】

: 做个烂PCR也跟天赋扯上了，提质粒是不是也是天赋啊，廓狐还是kit提哦
: 难怪人说学生物的笨

c*a2014-12-23 08:12

11 楼

不pp的话，只能慢慢排队。

l*e2014-12-23 08:12

12 楼

用这个，百试不爽
http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-p

【在 y*****0 的大作中提到】

x*e2014-12-23 08:12

13 楼

PCR是要看基因的吧，不是每个基因都好p，特别是gDNA

【在 s******y 的大作中提到】

: 直接quit了算了
: 还有比做PCR更简单的活儿吗？

Z*52014-12-23 08:12

14 楼

可以出band，但比较模糊的情况下，可以考虑试一下touchdown

j*n2014-12-23 08:12

15 楼

试过常规的optimization没，例如退火温度，可以做个gradient试试或者touchdown
还是不行的话，可以考虑换enzyme或者buffer
推荐epicentre的FailSafe™ PCR PreMix Selection Kit
有12种不同离子强度的buffer 从适合高AT的A buffer到适合高GC的L buffer
对于某些特殊的基因，只有某一种或两种buffer好用其他的都不行

s*i2014-12-23 08:12

16 楼

+ 10% 5M betain 试试，sigma有卖

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 y*****0 的大作中提到】

y*02014-12-23 08:12

17 楼

谢谢各位牛人啦！

【在 s*****i 的大作中提到】

: + 10% 5M betain 试试，sigma有卖
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

x*t2014-12-23 08:12

18 楼

加2ul的DMSO试试，或者用GC buffer

【在 y*****0 的大作中提到】

y*02014-12-23 08:12

19 楼

已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
分谢谢！

【在 x*******t 的大作中提到】

: 加2ul的DMSO试试，或者用GC buffer

m*D2014-12-23 08:12

20 楼

好多年不作PCR了。上个月也是作genomic PCR,才两三KB，也碰到了同样问题。后来用
NEB的Q5 polymerase加GC enhancer解决。你试试？

l*e2014-12-23 08:12

21 楼

有什么区别么，不就是一个transgene

【在 y*****0 的大作中提到】

: 已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
: 试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
: 后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
: 分谢谢！

t*l2014-12-23 08:12

22 楼

最简单的方法！换primer

n*k2014-12-23 08:12

23 楼

别理他们，你这个难度估计有哈；不过这种文库的东东BAND应该SHARP吗？
如果从纯优化PCR条件而言，现在完全不值得自己优化条件，换酶，换引物，换体系等
远比优化来的方便；如果是比较特殊的PCR，那一开始就要考虑到选对几个备选的PCR扩
增体系。这些都考虑到了，还需要自己优化的，那就要有对PCR的深入了解和经验了，
建议在周围找一个这样的“牛"人,详细讨论了。

【在 y*****0 的大作中提到】